郭天奇 李雪 綜述 周延民 趙靜輝 審校

口腔材料直接與牙周組織和黏膜上皮相接觸，廣泛應(yīng)用于口腔種植修復(fù)、牙體牙髓治療等領(lǐng)域中，其生物安全性尤其是潛在的致癌可能性尤為重要。

遺傳毒性試驗是指通過不同檢測手段檢測受試物直接或間接誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)損傷的體外和體內(nèi)試驗[1]。近年來，對于遺傳毒性的評價方法在不斷改進(jìn)和完善。據(jù)報道,目前已建立的遺傳毒性短期檢測法已超過200種。我國曾在GB/T16886.3—2008標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定：體外法評價遺傳毒性實驗應(yīng)組合選用細(xì)菌回復(fù)突變試驗(OECD471)、體外哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗(OECD476)和染色體畸變實驗(OECD473)，或者單純應(yīng)用前兩者，體外法評價遺傳毒性實驗可以聯(lián)合選用微核試驗(OECD474)及嚙齒動物中期骨髓分析(OECD475)。隨著實驗手段的進(jìn)展及新方法的出現(xiàn)，其他多種具有不同優(yōu)點的遺傳毒性試驗也逐漸被國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)并認(rèn)可?，F(xiàn)今在評價口腔材料生物安全性的過程中，國內(nèi)外學(xué)者最常見應(yīng)用的幾種實驗主要為：彗星實驗，微核試驗，染色體畸變實驗，H2AX探針測量DNA雙鍵斷裂，測量反應(yīng)性氧的濃度以及細(xì)菌回復(fù)突變試驗等[2-3]。本文就這幾種常見的實驗進(jìn)行論述和總結(jié)，并對它們相對的優(yōu)缺點進(jìn)行評價。

1 單細(xì)胞凝膠電泳實驗

單細(xì)胞凝膠電泳實驗(SCGE)是一種在單個細(xì)胞水平上檢測真核細(xì)胞DNA損傷的一種靈敏且簡單的技術(shù)，這門技術(shù)由Ostling等在1984年首次提出，Singh等[4]將其改進(jìn)。其原理：高鹽裂解溶液破壞細(xì)胞膜，將細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)游離，而相對分子質(zhì)量較大的染色質(zhì)則留在原位，通電電泳使得受損傷的DNA片段在電場作用下游離出來，而未受損傷的DNA分子則繼續(xù)留在原位。經(jīng)溴乙啶染色后，染色質(zhì)在紫外線照射下發(fā)出熒光，受損的細(xì)胞呈現(xiàn)“彗星”外觀，明亮的頭部為“彗核”，受損的DNA斷片脫離彗核組成“彗尾”，故這種檢測方法也被稱為comet assay(彗星實驗)。細(xì)胞DNA斷片越多、相對分子質(zhì)量越小，形成的“彗尾”越長。該實驗測定細(xì)胞DNA受損的程度，一般有3 個指標(biāo)：彗尾的長度、強(qiáng)度及尾矩。通常用堿性裂解液(pH>13)處理細(xì)胞，不僅可以使細(xì)胞內(nèi)蛋白成分分離更加徹底，也有利于DNA雙螺旋破壞和單鏈片段移行，Collins等[5]指出SCGE對于DNA超螺旋的解旋情況。

外周血直接提取的淋巴細(xì)胞提取方法簡易，成本低廉，提取分離后可以即刻進(jìn)行試驗，故常見于評價口腔生物材料安全性的SCGE實驗中：Droidz等[6]提取人血液分離出的淋巴細(xì)胞用堿性和中性SCGE法發(fā)現(xiàn)0.15 mmol/L的Bis-GMA即可以使得DNA雙鍵斷裂，并且會阻礙淋巴細(xì)胞本身的DNA修復(fù)過程。Poplawski等[7]應(yīng)用人血淋巴細(xì)胞行SCGE，發(fā)現(xiàn)：2.5 μmol/L的GMA就可以阻礙90%以上淋巴細(xì)胞的DNA修復(fù)過程。Kaya等[8]也提取成人外周血液內(nèi)的淋巴細(xì)胞，通過SCGE電泳結(jié)果的尾長、尾強(qiáng)、尾矩3 個指標(biāo)評價了不同粘接劑的遺傳毒性。Brzovic等[9]選用外周血淋巴細(xì)胞評價了6 種不同品牌的根管充填劑的致畸變毒性。Baraba等[10]同樣選用外周血淋巴細(xì)胞通過評價了彗尾的長度及強(qiáng)度，證實了2 種樹脂基的根管充填材料具有較好的遺傳安全性。

SCGE對細(xì)胞并沒有特殊要求，理論上只要是真核細(xì)胞就可以進(jìn)行SCGE實驗。Tavares等[11]將CHO-K1(小鼠卵巢細(xì)胞)附著在純鈦以及等離子體處理的鈦片上培養(yǎng)24 h后，通過comet assay證實等離子體處理組的尾矩有顯著降低，提示對于grade=2的純鈦，等離子體表面處理可以提高鈦片的生物相容性。Volk等[12]選用健康成人的牙齦細(xì)胞評價了不同濃度樟腦醌的遺傳毒性。Pligina等[13]選用Hela細(xì)胞系評價了5 種不同根管沖洗液的致畸變毒性。Marins等[14]選用小鼠成纖維細(xì)胞3T3-L1證實了較低濃度的次氯酸鈉(2.5%)以及較高濃度的檸檬酸(21%)即具有相對較強(qiáng)的致畸變毒性。

在評價口腔材料的遺傳毒性方面，SCGE法簡便易行、實驗周期較短、重復(fù)性好、靈敏度高，可以測出每1.657×10-18kgDNA中1 個堿基對的斷裂，可選用的受試細(xì)胞范圍廣泛，理論上講，SCGE法可以適用于任何真核細(xì)胞，甚至適用于分離出來的染色體[15]。

2 DNA雙鍵斷裂探針(γ-H2AFX foci)

H2AFX，是H2A組蛋白家族的成員之一，由組蛋白H2A基因編碼，在真核生物的細(xì)胞中，DNA纏繞在各種組蛋白上包含H2A，H2B，H3等成分[16]，因此，H2AX是核小體以及DNA結(jié)構(gòu)的基本組成部分[17]。經(jīng)過絲氨酸-139磷酸化后，H2AX轉(zhuǎn)換為γ-H2AX foci，同時也是DNA雙鏈斷裂誘導(dǎo)產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物[18]，PI-3家族的激酶DNA-PK,ATM和ATR激酶均參與了磷酸化的反應(yīng)，從而參與DNA雙鏈斷裂(DSBs)的修復(fù)[19]，因為一旦DNA的排列變得更加稀疏，會有更多的空間供DNA修復(fù)蛋白就位，也證明了γ-H2AX foci有較強(qiáng)的DNA修復(fù)能力[20]。電離輻射可以導(dǎo)致DSBs的出現(xiàn)，并產(chǎn)生γ-H2AX foci，將γ-H2AX foci與特定的系列熒光性抗體結(jié)合，可以通過測量熒光度的方法定量計算DSBs的出現(xiàn)[21]。

Shehata等[22]表示：DNA修復(fù)過程不能完全抵消已經(jīng)造成的DNA損傷，因此γ-H2AX foci雖然在細(xì)胞內(nèi)起到修復(fù)DNA雙鍵斷裂的作用，同時也成為檢測細(xì)胞內(nèi)DNA雙鍵斷裂的一個敏銳的指標(biāo)。γ-H2AX無論在體內(nèi)還是體外實驗中，都具有靈敏的檢測早期微量DSBs的作用。環(huán)境中僅僅1 mGy的電離輻射即可影響細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX的水平，其靈敏度達(dá)到了傳統(tǒng)染色體畸變實驗的100 倍[23]。Cogan等[24]通過測量γ-H2AX的表達(dá)從而證實了四價鉻離子對成纖維細(xì)胞的遺傳毒性。Durner發(fā)現(xiàn)[25]與0.25 mmol/L濃度的BisGMA接觸24 h后，細(xì)胞受損產(chǎn)生的Gamma-H2AX foci含量相當(dāng)于接受了4 Gy的射線照射的量。

3 微核試驗

微核(micronucleus,MCN)，是分裂間期細(xì)胞中染色體畸變的一種表現(xiàn)形式。19 世紀(jì)末，Howell和Jolly兩位學(xué)者分別在人外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)Feulgen染色陽性的微小的細(xì)胞核樣物質(zhì)，并將其命名為Howell-Jolly小體，這一小體便是微核(MCN)[26]。微核實驗主要以觀測有絲分裂期間未能達(dá)到紡錘體極的染色體片段或者整條染色體為目標(biāo)[27]。

鏡下篩選微核的標(biāo)準(zhǔn)如下：微核直徑不大于主核的1/3。顏色必須與主核一致或者略深于主核，必須位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。2001年Fenech等[28]將這一標(biāo)準(zhǔn)修改為：微核直徑需在主核的1/3到1/16之間。然而計數(shù)為微核的標(biāo)準(zhǔn)并不絕對，Tavares等[11]在實驗中，將分裂末期雙細(xì)胞核之間的染色質(zhì)橋以及主核上未完全分離的小球樣染色質(zhì)結(jié)構(gòu)也記做微核。微核試驗，同SCGE一樣，都是在單個細(xì)胞水平上進(jìn)行評價。一般統(tǒng)計500～1 000 個細(xì)胞，每個細(xì)胞都作為一個樣本，也保證了實驗充足的樣本量。

微核試驗既可以做體內(nèi)實驗，也可以做體外實驗。許多學(xué)者甚至直接刮取患者的口腔黏膜細(xì)胞進(jìn)行微核試驗。Natarajan等[29]發(fā)現(xiàn)鎳鉻正畸托槽會顯著升高頰粘膜細(xì)胞的微核頻率。Klaric等[30]計數(shù)了應(yīng)用牙齒漂白劑的患者的微核形成總量。Azhar等[31]選取常年與MMA單體接觸的14 名口腔醫(yī)生的頰黏膜細(xì)胞并作微核試驗探究MMA單體的致畸變毒性。

動物微核試驗的體內(nèi)方法主要以小鼠為受試物，給藥方式可以尾靜脈注射[32]，可以口服，也可以是腹腔注射。微核試驗的體外細(xì)胞實驗研究可以選用的受試細(xì)胞廣泛，但大多以淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為主。Fernandez等[33]選用小鼠3T3/NIH成纖維細(xì)胞證實了過碳酸鈉以及過硼酸鈉對成纖維細(xì)胞具有致畸變毒性。Camárgo等[34]選用中國倉鼠V79成纖維細(xì)胞比較了不同根管充填劑的遺傳毒性。Demirci等[35]同樣選用V79成纖維細(xì)胞進(jìn)行微核試驗來測量7 種不同品牌的粘接劑的遺傳毒性 。Laurent等[36]直接提取人血液中淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)各個濃度的Ca3SiO5提取液與陰性對照組的微核形成率并無顯著差異，從而證實Ca3SiO5并無明顯致畸變毒性。

微核試驗不僅可以偵測染色體組的損傷，同時可以偵測出染色體丟失以及有絲分裂中期紡錘體的異常[37]，所以在甄別口腔生物材料是否具有致畸變特性中，很多學(xué)者都選用微核試驗或者聯(lián)合微核試驗與其他實驗共同應(yīng)用。

4 染色體畸變實驗

染色體畸變指染色體數(shù)目的增減或結(jié)構(gòu)的改變，鏡下觀察染色體畸變一般有如下幾種表現(xiàn)：染色體溝，染色體斷裂，染色單體交換[38]，雙著絲粒染色體，環(huán)狀染色體以及染色體碎片。也有學(xué)者將染色單體溝和染色單體斷裂作為計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)[39]。

染色體畸變實驗對細(xì)胞沒有明確限制，原則上只要是真核細(xì)胞就可以，在評價口腔生物材料的致畸變毒性時，學(xué)者們曾選用MRC-5細(xì)胞、牙髓細(xì)胞[40]、外周血淋巴細(xì)胞[41-42]等。一般每組計數(shù)100 個細(xì)胞,常規(guī)Giemsa染色后即可進(jìn)行鏡下觀察。

Tavares等[11]發(fā)現(xiàn)等離子體處理會使得鈦片更具有抗腐蝕性從而析出較少的鈦粒子，該結(jié)論也與作者進(jìn)行的SCGE實驗結(jié)論一致。染色體畸變實驗方法簡單易行，觀測手段直接，然而靈敏度并不高，所以該方法多與SCGE以及微核試驗聯(lián)合應(yīng)用。

5 活性氧類的測量

活性氧類(ROS)指細(xì)胞內(nèi)含有氧自由基的化學(xué)活性物質(zhì)，細(xì)胞正常代謝產(chǎn)生的ROS對于細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)以及維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)有著重要作用。細(xì)胞接收到外界環(huán)境不適宜刺激(如過多的紫外線)后，ROS的含量則會迅速上升，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，這種應(yīng)激反應(yīng)稱之為氧化應(yīng)激[43]。

ROS對于細(xì)胞的損傷體現(xiàn)在以下幾方面：DNA原始損傷，脂質(zhì)的過氧化，氨基酸的過氧化變性，激活體內(nèi)無活性的特定酶[44]。ROS導(dǎo)致的DNA氧化是基因突變的主要原因，誘變結(jié)果主要包括生成8-羥基鳥嘌呤，DNA單鏈斷裂，加合蛋白質(zhì)和DNA使得DNA鏈內(nèi)交聯(lián)或鏈間交聯(lián)等[45]。最常見的突變是生成8-羥基鳥嘌呤，后者在DNA的復(fù)制過程中，錯誤的與腺嘌呤配對，并最終導(dǎo)致G變?yōu)門的轉(zhuǎn)換突變。

過量的ROS會通過多種通路促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[46]，F(xiàn)as配體產(chǎn)生ROS的同時會促進(jìn)Fas配體本身的磷酸化，從而產(chǎn)生Caspase8，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。另一種通路是ROS通過激活細(xì)胞核穩(wěn)定蛋白質(zhì)Bcl-2的表達(dá)以促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放[47]。

在評價口腔生物材料方面，通常選取牙髓細(xì)胞[48]以及牙齦成纖維細(xì)胞[49]進(jìn)行ROS的測量。而ROS的檢測方法一般都應(yīng)用無熒光的DCF，其在體內(nèi)會被激酶轉(zhuǎn)化為DCFH，后者可以被細(xì)胞質(zhì)中的ROS氧化變?yōu)榘l(fā)熒光的DCF-DA[50],發(fā)出波長為Ex/Em=485/528 nm的熒光，通常通過光度計可以定量DCF-DA從而反映出細(xì)胞質(zhì)內(nèi)ROS的量[51]。

6 鼠傷寒沙門氏桿菌回復(fù)突變實驗

鼠傷寒沙門氏桿菌回復(fù)突變實驗又稱Ames試驗，組氨酸缺陷型測試菌株，不能在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基中大量生長，只能形成幾個微小的菌落，將菌株與被檢化合物接觸后，如果該化合物具有致突變性，則化合物可使該菌株發(fā)生回復(fù)突變，重新成為野生型菌株[52]，發(fā)生回復(fù)突變后，菌株可大量在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上生長并形成肉眼可見的菌落。Ames試驗主要檢測DNA的堿基置換和移碼突變，具有不錯的的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性[53]。常用的4 種菌株中，TA97、TA98可檢測移碼突變，TA100可檢測堿基置換，而TA102可同時檢測移碼突變和堿基置換。Chen等[54]通過Ames實驗證實凝膠處理的硅表面涂層材料不具有致畸變毒性。Ames實驗更多與其他實驗如SCGE，微核試驗[55]聯(lián)合應(yīng)用，對評價口腔生物材料的致畸變毒性起到相輔相成的作用。

7 結(jié) 語

評價口腔材料的遺傳毒性試驗多種多樣，各實驗的針對畸變位點也不盡相同[55]，在遺傳毒性檢測中，學(xué)者們極少單一應(yīng)用某種試驗的結(jié)果得出受試物的致畸變特點，而多是聯(lián)合應(yīng)用多種方法，使其結(jié)果相互驗證，方法優(yōu)勢互補(bǔ)，以保證實驗的靈敏度及提高可信度。不同實驗的聯(lián)合應(yīng)用，通過各實驗陽性結(jié)果的差異分析可以得知受試物的具體致癌性機(jī)制。