陳 田戴思慧沈鵬原賀向榮鐘 晴劉東波,3,4

CHEN Tian1,2 DAI Si-hui1 SHEN Peng-yuan1,2 HE Xiang-rong1 ZHONG Qing1 LIU Dong-bo1,2,3,4

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院，湖南 長沙 410128；2. 國家中醫(yī)藥管理局亞健康干預技術(shù)實驗室，湖南 長沙 410128；3. 湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點實驗室，湖南 長沙 410128；4. 湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128)

(1. College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China; 2. State Key Laboratory of Subhealth Intervention Technology, Changsha, Hunan 410128, China; 3. Hunan Provincial Key Laboratory of Crop Germplasm Innovation and Utilization, Changsha, Hunan 410128, China; 4. Hunan Coinnovation Center for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha, Hunan 410128, China)

南瓜[Cucurbitamoschata(Duch. Ex Lam.)Duch. Ex Poir]屬葫蘆科(Cucurbitaceae)南瓜屬(Cucubita)一年生草本植物[1]，在中國種植范圍廣，資源豐富，品種繁多，其口感甜美細膩，且具有降血糖、降血壓等功效[2]。南瓜籽是南瓜的成熟種子，其油脂含量豐富，經(jīng)榨取或浸提即得南瓜籽油[3]。2017年10月27日國家糧食局頒布了LS/T 3250—2017《南瓜籽油》標準，南瓜籽油正式進入食用油行列。南瓜籽油含有豐富的不飽和脂肪酸、植物甾醇、角鯊烯、氨基酸、胡蘿卜素、礦物質(zhì)及多糖等營養(yǎng)成分[4]，具有降血糖[5]、抑制男性禿頭[6]、殺蟲[7]、治療前列腺增生[8]等作用。

裸仁南瓜是南瓜的一種籽仁突變品種，在南瓜生長進化過程中，由籽仁木質(zhì)素的降低和缺失使種皮的第 2～4細胞層坍塌[9]。由于沒有堅硬的外殼，可以直接食用，在食品加工過程中省去了剝皮的步驟，節(jié)省了大量的成本，具有很高的推廣價值[10]。已有學者對裸仁南瓜籽油的萃取工藝和營養(yǎng)價值進行研究，如李全宏[11]探索了超臨界CO2流體萃取裸仁南瓜籽油的工藝，及其對油質(zhì)量的影響。劉玉梅等[12]分析了裸仁南瓜籽的營養(yǎng)成分如粗脂肪、粗纖維、粗蛋白質(zhì)、微量元素等的含量，及裸仁南瓜籽油的脂肪酸組成和含量，發(fā)現(xiàn)鐵、鋅、銅、錳顯著高于普通南瓜籽。裸仁南瓜籽油脂肪酸含量高，主要包含以油酸和亞油酸為主的不飽和脂肪酸，其中亞油酸含量較花生油和菜籽油高。但目前對裸仁南瓜籽油其他活性成分，如植物甾醇、角鯊烯的組成及相對含量未見報道，其抗氧化功效研究也缺乏。

本研究根據(jù)LS/T 3250—2017《南瓜籽油》標準檢測裸仁南瓜籽油，以香味純正清郁、營養(yǎng)價值高、深受消費者青睞的葡萄籽油[13]和亞麻籽油[14]作為參照，采用GC-MS、HPLC分析比較裸仁南瓜籽油活性成分及其含量，并對裸仁南瓜籽油體外抗氧化活性進行評價，旨在為裸仁南瓜籽油的進一步開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

裸仁南瓜籽油：依據(jù)本課題組專利[15]方法通過超臨界CO2萃取，在萃取壓力25 MPa，萃取溫度40 ℃，分離溫度50 ℃，分離壓力10 MPa條件下獲得；

葡萄籽油、亞麻籽油：河南省鯤華生物技術(shù)有限公司；

角鯊烯標準品：純度≥99.5%，中國藥品生物制品檢定所；

甲醇：色譜純，德國Merch kGaA 公司；

DPPH(2，2-Diphenyl-1-picryhydrazyl)、ABTS[2,2-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6磺酸)二銨鹽]：分析純，美國Sigma公司；

BSTFA+TMCS(99∶1)試劑： 梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；

福林酚試劑：合肥博美生物技術(shù)有限公司；

Tris-HCl試劑：全式金生物技術(shù)有限公司；

沒食子酸、氫氧化鉀、正己烷、無水硫酸鈉、石油醚、苯、二氯甲烷七水合硫酸亞鐵鄰苯三酚、過硫酸鉀、鐵氰化鉀：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

三氯乙酸石油醚：沸程60～90 ℃，純度≥98%，百靈威科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子分析天平：AE240型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；

pH計：S210 SevenCompact型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：GCMS-QP2020型，日本島津公司；

紫外分光光度計：UV-1800型，日本島津公司；

超聲波清洗器：KQ5200DE型，昆山超聲儀器有限公司；

電熱恒溫干燥箱：DHG9246型，上海精紅實驗設(shè)備有限公司；

離心機：2-16R型，湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 裸仁南瓜籽油質(zhì)量檢測

(1) 水分及揮發(fā)物的測定：直接干燥法，按GB 5009.236—2016進行，重復測定3次。

(2) 酸價的測定：冷溶劑指示劑滴定法，按GB 5009.229—2016進行，重復測定3次。

(3) 過氧化值的測定：滴定法，按GB 5009.227—2016進行，重復測定3次。

1.2.2 脂肪酸組成分析 準確稱取裸仁南瓜籽油50.0 mg于試管中，加入體積比為1∶1的石油醚-苯混合溶劑2 mL溶解，加入0.4 mol/L的KOH-甲醇溶液2 mL，混勻后于室溫放置30 min，加2 mL蒸餾水混勻，于5 000 r/min離心10 min，取上清液待測。采用峰面積歸一法得出各脂肪酸的相對含量，各色譜峰相應的質(zhì)譜圖檢索采用NIST標準普庫。葡萄籽油和亞麻籽油作相同處理。

(1) GC條件：選用SH-RXi-5Sil MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm) 毛細管色譜柱；升溫程序為起始溫度 70 ℃，保持3 min，以10 ℃/min 升溫至 180 ℃，再以 2 ℃/min升溫至200 ℃，保持1 min，最后以 3 ℃/min 升溫至220 ℃，保持15 min；進樣口溫度250 ℃，載氣為高純氦氣，分流比50∶1，柱流量1 mL/min，進樣量1 μL，溶劑延遲3 min。

(2) MS條件：電離方式為EI，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍是40～550 u，全掃描方式。

1.2.3 植物甾醇組成分析 取3.00 g裸仁南瓜籽油，加入1.5 mol/L 的KOH-乙醇溶液30 mL，于80 ℃水浴回流，進行皂化反應2 h。皂化完成，趁熱加入5 mL的蒸餾水，以皂化液和正己烷體積比為1∶1萃取2次，皂化液和正己烷體積比為2∶1萃取1次，合并萃取液，經(jīng)蒸餾水，20% KOH溶液，20%乙醇溶液，蒸餾水依次洗滌，至流出液為中性。合并上層正己烷層，加適量無水硫酸鈉除水，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得干的不皂化物。取適量不皂化物，加200 μL BSTFA+TMCS(99∶1)試劑在80 ℃下衍生40 min，冷卻，加入0.5 mL CH2Cl2溶液，得衍生化樣品，待測。采用峰面積歸一法得出各植物甾醇的相對含量，各色譜峰相應的質(zhì)譜圖檢索采用NIST標準普庫。葡萄籽油和亞麻籽油作相同處理。

(1) GC條件：選用SH-RXi-5Sil MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細管色譜柱；升溫程序為初始溫度150 ℃，保持3 min，以15 ℃/min升至290 ℃，保留20 min；進樣口溫度280 ℃，載氣為高純氦氣，分流比50∶1，柱流量1 mL/min，進樣量1 μL，溶劑延遲3 min。

(2) MS條件：EI離子源，電子能量70 eV，離子源的溫度為230 ℃，接口溫度為280 ℃，質(zhì)量掃描范圍是40～550 u，全掃描方式。

1.2.4 角鯊烯含量測定

(1) 供試樣品溶液制備：取1.2.3所得的不皂化物，加甲醇溶解，定容至10 mL。得供試樣品。所制得的供試樣品按照1.2.4(3)色譜檢測條件進樣，計算裸仁南瓜籽油角鯊烯含量，試驗設(shè)置3組平行。葡萄籽油和亞麻籽油作相同處理。

(2) 角鯊烯的標準曲線：準確稱取角鯊烯標準品20.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，獲得濃度為2 mg/mL的母液。分別取0.15，0.30，0.45，0.60，0.75 mL于10 mL容量瓶，溶解定容，制成0.30，0.60，0.90，1.20，1.50 mg/mL的標準溶液，按照1.2.4(3)色譜檢測條件進樣5 μL，以角鯊烯濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標制作標準曲線。

(3) 高效液相色譜條件：Agilent-ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇，等度洗脫；柱溫30 ℃，流速0.8 mL/min，進樣10 μL，檢測波長210 nm。

1.2.5 抗氧化活性研究

(1) 清除 DPPH自由基能力的測定：參考文獻[16～17]的方法，研究裸仁南瓜籽油清除 DPPH自由基的能力。葡萄籽油和亞麻籽油作相同處理。

(2) 清除ABTS自由基能力的測定：參考文獻[18]的方法，研究裸仁南瓜籽油清除ABTS自由基的能力。葡萄籽油和亞麻籽油作相同處理。

(3) 抗氧化能力評價指標的計算：以油樣濃度為橫坐標，抗氧化能力為縱坐標，研究其相關(guān)性及變化趨勢，求得計算公式。50%清除率對應的濃度值為油樣自由基清除能力的IC50值，R為相關(guān)系數(shù)，表示相關(guān)性(R值越接近1，相關(guān)性越好)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 通過Excel 2013處理數(shù)據(jù)，利用OriginPro 8.6作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 裸仁南瓜籽油質(zhì)量

裸仁南瓜籽油的水分及揮發(fā)物為0.03%、酸價為1.32 mg/g、過氧化值為0.03 g/100 g，符合LS/T 3250—2017標準。

2.2 脂肪酸組成

裸仁南瓜籽油、葡萄籽油、亞麻籽油脂肪酸的GC-MS總離子流圖見圖1，脂肪酸組成及相對含量見表1。結(jié)果表明：裸仁南瓜籽油含有12種脂肪酸，以棕櫚酸、硬脂酸、共軛亞油酸為主。其中飽和脂肪酸8種，不飽和脂肪酸4種。不飽和脂肪酸含量高達74.68%，其中順式單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸相對含量分別為29.14%，45.54%。

2.3 植物甾醇組成

裸仁南瓜籽油、葡萄籽油、亞麻籽油植物甾醇的GC-MS總離子流圖見圖2，植物甾醇組成及相對含量見表2 。結(jié)果表明：3種油脂中植物甾醇含量最高的均為β-谷甾醇，在裸仁南瓜籽油中，β-谷甾醇含量達30.75%，△-7植物甾醇(麥角甾-7,22-二烯-3β-醇、膽甾-7-烯-3β，5α-二醇)含量相對較高，達10.76%，在葡萄籽油和亞麻籽油未檢測出麥角甾-7,22-二烯-3β-醇。

2.4 角鯊烯含量

角鯊烯標準品、裸仁南瓜籽油、葡萄籽油、亞麻籽油的HPLC色譜圖見圖3。角鯊烯標準曲線方程為Y=11.048X-17.61，R2=0.997 2，角鯊烯含量在300～1 500 μg/mL時線性關(guān)系良好；供試樣品連續(xù)進樣6次，RSD為7.15%。根據(jù)標準曲線計算，裸仁南瓜籽油、葡萄籽油、亞麻籽油中角鯊烯含量依次為5 490.00，68.45，19.62 μg/g。裸仁南瓜籽油中的角鯊烯含量顯著高于葡萄籽油和亞麻籽油。

圖1 脂肪酸檢測的總離子流圖

表1 脂肪酸組成及相對含量?

? “*”表示不飽和脂肪酸；“—”表示未檢測出。

表2 植物甾醇組成及相對含量?

? “—”表示未檢測出。

2.5 抗氧化活性評價

2.5.1 DPPH自由基清除能力 圖4和表3表明，3種油對DPPH自由基的清除能力與其濃度呈正相關(guān)，其中裸仁南瓜籽油對DPPH自由基具有良好的清除能力。裸仁南瓜籽油在濃度為20 mg/mL時， 清除率達52.20%，高于葡萄籽油(37.98%)和亞麻籽油(43.51%)的。從IC50值來看，3種油對DPPH自由基清除能力大小順序為：裸仁南瓜籽油>亞麻籽油>葡萄籽油。

2.5.2 ABTS自由基清除能力 圖5和表4表明，3種油對ABTS自由基的清除能力與其濃度呈直線正相關(guān)，其中裸仁南瓜籽油對ABTS自由基具有較優(yōu)的清除能力。在低濃度時，裸仁南瓜籽油和亞麻籽油對ABTS自由基清除能力相當，均低于葡萄籽油；隨著濃度的增加，裸仁南瓜籽油對ABTS自由基清除能力增長快于其他2種油，濃度為16 mg/mL 時，裸仁南瓜籽油對ABTS自由基的清除能力與葡萄籽油相當，優(yōu)于亞麻籽油。從IC50值來看，3種油對ABTS自由基清除能力大小順序為：葡萄籽油>裸仁南瓜籽油>亞麻籽油。

圖2 植物甾醇檢測的總離子流圖

3 結(jié)論

通過對裸仁南瓜籽油的活性成分檢測分析，裸仁南瓜籽油的不飽和脂肪酸、β-谷甾醇、△-7植物甾醇和角鯊烯含量分別為74.68%，30.75%，10.76%，5 490 μg/g，其β-谷甾醇、△-7植物甾醇和角鯊烯含量顯著高于葡萄籽油和亞麻籽油，角鯊烯含量顯著高于文獻[19]報道的市售普通南瓜籽油的平均含量(1.14 μg/g)。天然植物甾醇具有良好的降膽固醇、抗炎、抗癌等功效[20-21]，△-7植物甾醇可抑制由二氫睪酮過多引起的前列腺增生[22]；角鯊烯為天然的抗癌、抗氧化劑，被廣泛應用到食品、化妝品和醫(yī)藥行業(yè)[23]。因此可將裸仁南瓜籽油開發(fā)為具有降膽固醇、抗癌、抗氧化的保健油脂或進一步研究其功能成分，應用到化妝品、藥品等行業(yè)。

圖4 不同油脂對DPPH自由基的清除率

圖5 不同油脂對ABTS自由基的清除率

油樣線性回歸方程IC50/(mg·mL-1)R裸仁南瓜籽油y=27.830ln(x)-27.40916.140.973 4葡萄籽油 y=39.911ln(x)-79.45025.620.989 3亞麻籽油 y=34.832ln(x)-56.74021.420.979 5

表4 不同油脂對ABTS自由基的清除效果

對裸仁南瓜籽油進行體外抗氧化活性評價發(fā)現(xiàn)，裸仁南瓜籽油對DPPH、ABTS自由基具有良好的清除能力，抗氧化活性較強，可能與其高含量的不飽和脂肪酸、植物甾醇，尤其是角鯊烯相關(guān)，但具體機制還需進一步研究。下一步將對裸仁南瓜籽油的活性部位進一步分離純化，以明確其抗氧化作用的主要組分及裸仁南瓜籽油抗氧化機制。