梁崇 廖莉莉

摘要 為優(yōu)化土茯苓的組織培養(yǎng)技術(shù)體系，提高土茯苓組織培養(yǎng)效率，促進其資源保護和合理開發(fā)利用。以土茯苓帶腋芽莖段為外植體，采用組織培養(yǎng)方法，研究不同外源激素配比對莖段叢生芽誘導分化和不定芽增殖的影響。結(jié)果表明：土茯苓莖段叢生芽誘導分化最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA1.2mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.2mg/L，芽誘導倍數(shù)達6.35，不定芽增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA1.5mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.2mg/L，其增殖數(shù)高達8.8，且芽生長良好。

關(guān)鍵詞 土茯苓;叢生芽;誘導分化;增殖

中圖分類號 S567.32 文獻標識碼 A

土茯苓（Smilax glabra Roxb.）為百合科菝葜屬植物，為傳統(tǒng)清熱解毒常用中藥，具有調(diào)中止瀉、健脾胃、強筋骨、除濕、利關(guān)節(jié)等功效[1，2]。現(xiàn)代分析土茯苓含生物堿、揮發(fā)油、已糖類、鞣酸、植物甾醇、琥珀酸、胡蘿b苷、落新婦苷、白藜蘆醇、異黃杞苷、異落新婦苷、抽皮素等多種成分[3，4]。臨床和藥理治療試驗表明，土茯苓具有利尿、鎮(zhèn)痛、抗癌、抗動脈硬化、抑菌抗炎及增強肌體免疫作用[5-10]。另外，土茯苓含有的甾體皂苷元為我國制作口服避孕藥的主要半合成原料[11]。廣西是土茯苓的道地產(chǎn)區(qū)，由于土茯苓功用逐年開發(fā)，其用量逐年增長，而土茯苓野生資源長年被無序利用及產(chǎn)地發(fā)展經(jīng)濟林對其生境的破壞，野生資源逐年消殆，市場貨源日漸緊缺[13]。因此，開展土茯苓的人工栽培以滿足市場需求勢在必行。

土茯苓的人工栽培需解決種苗問題，然而土獲等扦插及種子繁殖均不理想;在組培方面，只有少數(shù)學者作了一些研究[12，13]。但多采用土茯苓根莖做培養(yǎng)材料，一定程度上損耗了具有高藥用價值的資源。本試驗選擇取材方便且不具有較大藥用價值的土茯苓帶腋芽莖段進行叢芽的誘導與芽增殖培養(yǎng)優(yōu)化技術(shù)研究，以期變廢為寶，在原有組織培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上，進一步優(yōu)化改進培養(yǎng)技術(shù)，為土茯苓大規(guī)模快速高效繁殖提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選用引種的土茯苓植株，取當年生嫩莖為外植體

1.2 方法

1.2.1 無菌材料處理

將土茯苓嫩莖置洗衣粉水中浸泡5min，用自來水細流水沖洗8min;在超凈工作臺上用0.2%HgCl₂浸泡消毒8min，然后用無菌水浸洗3～4次，每次1min;將帶有嫩芽的外植體切成長約1.5cm[14]。

1.2.2 叢生芽誘導

以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度配比的6-芐基氨基腺嘌呤（6-BA）、激動素（KT）、茶乙酸（NAA）。設(shè)置13種培養(yǎng)基，見表1。每種培養(yǎng)基20瓶，每瓶接種1個外植體，在培養(yǎng)條件含蔗糖2.5%，瓊脂0.5%，溫度（25±2）℃，光照時間10h/d，光照強度1500～20001x下培養(yǎng)[14]。培養(yǎng)期間定時觀察叢生芽生長情況，培養(yǎng)粼]d后統(tǒng)計不定芽數(shù)。

1.2.3 叢生芽的繼代增殖

將誘導獲得的叢生芽分成單芽轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)。設(shè)置4種培養(yǎng)基，見表2。培養(yǎng)條件與

1.2.2 相同，培養(yǎng)40d后統(tǒng)計叢生芽的增殖數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同細胞分裂素及其濃度對叢生芽誘導分化的影響

細胞分裂素是植物組織培養(yǎng)中促進組織分化和生長的物質(zhì)，其不同種類及濃度對組織的分化和生長有不同程度的影響。在土茯苓莖段叢芽分化培養(yǎng)中，6-BA的作用效果比KT顯著。6-BA在0.6～1.8，芽的誘導倍數(shù)隨著濃度的升高而提高。從叢生芽數(shù)和芽的長勢來看，不同濃度的6-BA對土茯苓叢生芽的誘導有很大影響。隨著6-BA濃度的增加，叢生芽誘導數(shù)也不斷提高，當6-BA濃度達1.8mg幾時誘導叢芽數(shù)最多，誘導倍數(shù)為（3.35±0.6），比對照CK（0.4±0.48）提高了8倍多，芽較粗壯。當6-BA濃度大于1.8mg/L，叢生芽減少，嚴重玻璃化。在8個處理中，6-BA1.8mg/L芽誘導倍數(shù)最高，與其它各處理間存在極顯著差異，其次為6-BA1.2mg/L。因此，土茯苓叢生芽分化誘導以細胞分裂素6-BA，濃度1.2～1.8mg/L為宜。結(jié)果見表3。

2.2 不同外源激素及濃度配比對叢生芽誘導分化的影響

在不同外源激素及濃度配比的培養(yǎng)基中土獲苓莖段都有不同程度的叢生芽分化。從分化叢生芽數(shù)和芽的長勢來看，以12號培養(yǎng)基最佳，平均芽誘導倍數(shù)為（6.35±1.01），與其它培養(yǎng)基存在顯著性差異。相同的6-BA濃度下，添加低濃度NAA對芽的誘導有促進作用，同時減輕叢芽玻璃化;添加低濃度的KT可較大幅度提高叢芽的誘導倍數(shù)。結(jié)果見表4。

2.3 叢生芽的繼代增殖

叢生芽轉(zhuǎn)接于繼代培養(yǎng)基中，在4種不同外源激素配比的繼代培養(yǎng)基中均有不同程度的叢生芽增殖，且以16號培養(yǎng)基增殖最好，平均芽增殖倍數(shù)達（8.8±1.02），生長健壯，與其它增殖培養(yǎng)基存在顯著性差異;其次是巧號培養(yǎng)基。結(jié)果見表5、圖1。

3 討論與結(jié)論

植物內(nèi)源激素的調(diào)控是叢生芽成功誘導的重要因素。在植物組織培養(yǎng)過程中，外源生長物質(zhì)對植物形態(tài)的分化作用實際上是重新調(diào)整了內(nèi)源生長素和細胞分裂素的平衡，外植體組織中內(nèi)源激素水平的不同引起培養(yǎng)基中最適外源生長物質(zhì)濃度的變化[15]。植物的器官分化需要較嚴格的細胞分裂素和生長素平衡。因此，不同植物的組織培養(yǎng)就有不同生長物質(zhì)種類及濃度的需要。在土茯苓帶腋芽莖段叢生芽誘導和不定芽增殖培養(yǎng)試驗中，適當?shù)姆至阉睾蜕L素濃度對土茯苓叢生芽的分化有很大的影響。配比過低不利于叢生芽的誘導萌發(fā)，配比過高，則會導致叢生芽產(chǎn)生玻璃化。且2種細胞分裂素與生長素配比組合比單一細胞分裂素及單一細胞分裂素、生長素配比較好，這可能是因為在土茯苓離體培養(yǎng)中，6-BA雖是主要、需求量較大的外源細胞分裂素，但KT作為一種非天然的細胞分裂素被植物的葉、莖、緩慢吸收，其促進細胞分化、分裂、生長，誘導愈傷組織長芽的機理功能可能是6-BA所不具備的，少量KT的添加，可以使植物外植體達到一個新的完美平衡，從而促使叢生芽大幅度提高，這與廖莉莉[14]等研究的KT對金櫻子芽誘導與增殖影響結(jié)果相似，添加KT比前人研究的土茯苓芽增殖及同屬菝葜的嫩莖芽誘導增殖增加1倍以上[13，16]，且芽生長健壯。因此，土茯苓帶腋芽莖段叢生芽誘導培養(yǎng)中以6-BA1.2mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.2mg/L組合最好，誘導倍數(shù)可達6倍以上。不定芽增殖培養(yǎng)中，以6-BA1.5mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.2mg/L組合最好，增殖倍數(shù)可高達8.8，且芽長勢良好。

參考文獻

[1]鄧理有.土茯苓的新用途[J].藥膳食療，2004（s）：16.

[2]田君，池汝安，張越非，等.從土茯苓浸取液萃取黃酮的研究[J].解放軍藥學學報，2006，22（5）：340-342.

[3]沈爾安除濕毒抗癌魔的土茯苓[J].東方藥膳2006（7）-21.

[4]隋欣，暴悅梅大孔樹脂分離土茯苓黃酮的研究[J].食品研究與開發(fā)，2015，36（7）：48-51.

[5]張白嘉，劉亞歐，劉榴，等.土茯苓及落新婦苷抗炎、鎮(zhèn)痛、利尿作用研究[J].中藥藥理與臨床雜志，2004，20（1）：11-12.

[6]邱光清，許連好，林潔娜，等.土獲冬總皂甙的抗腫瘤作用研究[J].中藥藥理與臨床，2001，17（5）;14-15

[7]李強.土茯苓現(xiàn)代研究概述[J].中國藥業(yè)，2008（14）：76-78.

[8]王志強，邱世翠，宋海英，等.土茯苓體外抑茵作用研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2006，17（11）：2203-2204.

[9]殷網(wǎng)虎，袁武軍，曹美琳.土茯苓配方顆粒對臨床常見致病菌的抗菌研究[J].中國中醫(yī)急癥，2011，20（12）：1957-1958.

[10]徐強.土茯苓對細胞免疫和體液免疫的影響[J].中國免疫學雜志，1993，9（1）：39.

[11]黃少偉.土茯苓總黃酮與多糖的提取與分離[D].武漢：武漢工程大學，2008.

[12]曾宋君，昊坤林，陳國華，等.土茯苓離體快繁研究[J].中藥材，2005，28（1）：1-2.

[13]董青松，閆志剛，白隆華，等.土茯苓組織培養(yǎng)研究[J].中藥材，2014，37（1）：5-9.

[14]廖莉莉，藍祖栽，凌征柱金櫻子組織培養(yǎng)及植株再生研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2010，24（6）：22-24.

[15]肖尊安.植物生物技術(shù)（M].北京：化學工業(yè)出版社，2005：16-17，55-56.

[16]李青.菝葜組織培養(yǎng)及植株再生體系的建立[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學，2008：49.