李續(xù)博，姜廣宇，董 航*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040；2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002）

急性髓細(xì)胞白血病（Acute myeloid leukemia，AML）是一種惡性血液腫瘤[1-2]，急性早幼粒細(xì)胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）是急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）的一種亞型，以其獨(dú)特的染色體異常，即t（15；17）產(chǎn)生融合基因PML-RARα及其編碼的蛋白為主要特征[3-5]。使用全反式維甲酸（ATRA）、三氧化二砷（ATO）、化療藥物，或與化療藥物兼用是治療APL的主要策略[6]。雖然有可能在低風(fēng)險(xiǎn)的APL治療中獲得成功，但對(duì)高危APL治療成功案例尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，需要開(kāi)發(fā)治療高風(fēng)險(xiǎn)APL的治療藥物。

川芎嗪又名天然四甲基吡嗪，是從傘形科藁本屬植物川芎中分離提純的生物堿單體，是中藥川芎的主要有效成分。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪能有效抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。紫杉醇是一種微管穩(wěn)定劑，用作治療卵巢癌、乳腺癌和肺癌，肉瘤、淋巴瘤和白血病的化療藥物[8]。紫杉醇因其具有很高的協(xié)同作用，所以常與其他藥物聯(lián)合使用，可以克服單獨(dú)使用時(shí)產(chǎn)生的耐藥性[9]。所以本研究川芎嗪與紫杉醇聯(lián)用對(duì)急性早幼粒細(xì)胞的影響，探索治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的新策略。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 HL-60細(xì)胞（武漢普諾賽生命科技有限公司），紫衫醇（赫澎生物上海科技有限公司20170321），川芎嗪（赫澎生物上海科技有限公司20170925）。川芎嗪和紫衫醇在DMSO中溶解并在濃縮的蒸餾水中進(jìn)行濃縮至10 mM和1 M，過(guò)濾。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 在這項(xiàng)研究中我們使用HL-60細(xì)胞系作為人類急性早幼粒細(xì)胞白血病模型。HL-60細(xì)胞在含有1%的谷氨酰胺，1%青霉素/鏈霉素，10%熱滅活胎牛血清（FBS）RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)箱中保持37 ℃，5%二氧化碳和95%相對(duì)濕度。

1.3 細(xì)胞毒性試驗(yàn) 紫杉醇和川芎嗪對(duì)HL-60細(xì)胞的毒性作用使用細(xì)胞增殖劑WST-1（羅氏）測(cè)定。細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞濃度106個(gè)/mL。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，川芎嗪（10 μM～1 nM）和紫杉醇（10 mM～1 μM）處理細(xì)胞24 h，48 h，72 h。未經(jīng)處理的細(xì)胞作為對(duì)照組?；罴?xì)胞形成的形成甲瓚染料使用酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm和620 nm檢測(cè)。

1.4 細(xì)胞凋亡測(cè)定 紫杉醇與川芎嗪聯(lián)合用藥對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡的影響，使用AnnexinV EGFP細(xì)胞凋亡試劑盒和JC-1分析試劑盒。HL-60細(xì)胞1×106個(gè)/mL接種于6孔板中，紫杉醇與川芎嗪聯(lián)合用藥（4 μM川芎嗪和34 nM紫杉醇）處理細(xì)胞24 h、48 h 和72 h。結(jié)果通過(guò)對(duì)熒光顯微鏡Olympus BX51對(duì)200個(gè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)處理。

1.5 實(shí)時(shí)定量 PCR分析 測(cè)定mRNA表達(dá)的變化，聯(lián)合藥物處理細(xì)胞48 h內(nèi)聯(lián)合劑量（4 μM川芎嗪和34 nM紫杉醇）。用高純度RNA分離試劑盒提取總RNA。聯(lián)合藥物處理和未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期、凋亡與若干信號(hào)通路相關(guān)基因cDNA合成?；虻谋磉_(dá)是通過(guò)LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR研究?jī)x器II檢測(cè) ，2-△△CT法定量比較樣本對(duì)內(nèi)參的循環(huán)閾值的差異。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 IC50值和川芎嗪聯(lián)合紫衫醇對(duì)HL-60細(xì)胞劑量使用Calcusyn 2軟件進(jìn)行非線性回歸曲線計(jì)算。real-time RTPCR變化使用在線軟件統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性 IC50劑量，紫杉醇和川芎嗪72 h劑量分別為4.8 nM（R2= 0.896 1，P＜0.05）和398.7 m（R2=0.948 3，P＜0.05）（圖1、2），紫杉醇與川芎嗪最佳聯(lián)合劑量為34 nM和4 μM（R2= 0.975 74，P＜0.05）（圖3、4）。

2.2 川芎嗪聯(lián)合紫杉醇對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 紫杉醇和川芎嗪對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡的影響，Annexin V法，與對(duì)照組相比，聯(lián)合用藥 24 h，48 h，72 h分別為對(duì)照組的1.14倍，12.7倍，8.2倍（圖5）。JC-1法，與對(duì)照組相比，24 h，48 h和72 h，聯(lián)合劑量組細(xì)胞凋亡分別為對(duì)照組的2.5倍，9.4倍，114.3倍（圖6）。

圖1 紫杉醇對(duì)HL-60細(xì)胞的影響

圖3 川芎嗪聯(lián)合紫杉醇對(duì)HL-60細(xì)胞的影響

圖4 川芎嗪聯(lián)合紫杉醇對(duì)HL-60細(xì)胞的影響

圖5 紫杉醇對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡的影響

2.3 川芎嗪聯(lián)合紫杉醇對(duì)基因表達(dá)的影響 紫杉醇和川芎嗪的組合對(duì)HL-60細(xì)胞中24個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生了顯著的變化（P＜0.05）。其中22個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，2個(gè)基因表達(dá)上降。見(jiàn)表1。

3 討論

APL是AML的一種亞型，臨床早期由于彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）引起出血致死率非常高，使用全反式維甲酸降解PML/RARα融合蛋白，ATO或與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用是APL的主要治療策略[7]。雖然對(duì)低危患者的治療可以通過(guò)全反維甲酸- ATO聯(lián)合治療可以治愈，但對(duì)于高風(fēng)險(xiǎn)APL的治療成功案例尚未有報(bào)道。因此，開(kāi)發(fā)治療高危APL藥物是目前的迫切需要。

圖6 川芎嗪對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡的影響

紫杉醇是一種微管穩(wěn)定劑，用作治療卵巢癌、乳腺癌和肺癌，肉瘤、淋巴瘤和白血病的化療藥物[8]。紫杉醇因其具有很高的協(xié)同作用，所以常與其他藥物聯(lián)合使用，可以克服單獨(dú)使用時(shí)產(chǎn)生的耐藥性[9]。在臨床前細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究表明：紫杉醇與ATRA聯(lián)合用藥具有誘導(dǎo)急性髓白血病的協(xié)同作用[10]。單獨(dú)紫杉醇誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，0.1 μm和1 μm 24 h內(nèi)誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡分別為17.8倍和 16.5倍[11]。

川芎嗪又名天然四甲基吡嗪，是從傘形科藁本屬植物川芎中分離提純的生物堿單體，是中藥川芎的主要有效成分。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪能有效抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，這對(duì)白血病的髓外轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)具有積極的意義[12-15]。

細(xì)胞增殖與分化與正常造血系統(tǒng)密切相關(guān)。在細(xì)胞分裂過(guò)程中，兩個(gè)細(xì)胞中的一個(gè)維持干細(xì)胞的特性，另一種則維持干細(xì)胞的特性。單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的細(xì)胞系獲得的需求增加[16]。增生增加白血病的遺傳損傷的概率，損傷的DNA反應(yīng)通路有助于遺傳變異，導(dǎo)致白血病的加速形成[17]。因此，細(xì)胞周期調(diào)控因子如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)改變，細(xì)胞周期蛋白依賴激酶（CDK），控制點(diǎn)和有絲分裂激酶激酶導(dǎo)致不規(guī)則增生與分化的相互作用髓系惡性腫瘤的途徑。例如，CCND2頻繁表達(dá)高水平的B細(xì)胞惡性腫瘤如BLL，LPL[18]。此外，CDK6，具有造血功能的獨(dú)特作用，主要表達(dá)于造血細(xì)胞類型。這個(gè)小鼠胸腺萎縮和CDK6損失導(dǎo)致紅血減少細(xì)胞，粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞和血小板，以及因?yàn)樵贑DK6小鼠淋巴細(xì)胞G1晚期進(jìn)展[19-21]。

表1 川芎嗪聯(lián)合紫杉醇對(duì)基因表達(dá)的影響

在這項(xiàng)研究中，紫杉醇聯(lián)合川芎嗪促進(jìn)HL-60細(xì)胞細(xì)胞周期蛋白（CCNB1，CCNB2，CCNC，CCND1，CCND2，CCNE1，CCNF，CCNG1、CCNG2）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDC16、CDC20，CDC25A，CDC34、CDK1、CDK2、CDK4 、CDK5R1、CDK7，CDK8）表達(dá)下降。此外，細(xì)胞周期蛋白依賴性抑制激酶CDKN1B表達(dá)增加，DNA損傷應(yīng)答基因ATR 、CHEK1、CHEK2和細(xì)胞周期相關(guān)因子E2F4表達(dá)量降低。

在我們的研究中，川芎嗪在低劑量下具有協(xié)同作用。4 μM川芎嗪與34 nM紫杉醇聯(lián)合用藥誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡。因此，我們建議將紫杉醇和川芎嗪兩者結(jié)合起來(lái)的方法作為開(kāi)發(fā)治療APL的一種新的治療策略。