李志剛，陳寶峰，方智博，張中華，常景玲*

1(現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng)，453003) 2(河南科技學(xué)院 生命科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)，453003)

環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)是人體內(nèi)廣泛存在的一種生理活性物質(zhì)，作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，對(duì)糖代謝、脂肪代謝以及核酸和蛋白質(zhì)合成等具有重要的調(diào)節(jié)作用[1]。該物質(zhì)作為藥物和飼料添加劑廣泛應(yīng)用于心血管類疾病的治療和畜禽產(chǎn)品的生產(chǎn)中，具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值[2]。

微生物發(fā)酵生產(chǎn)cAMP的方法具有反應(yīng)條件溫和、成本低、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的工業(yè)化生產(chǎn)前景，受到越來越多的關(guān)注[3]。然而，微生物合成cAMP的過程存在兩個(gè)主要問題，制約著其發(fā)酵性能的提高。一方面，cAMP是由ATP在腺苷酸環(huán)化酶的催化下直接環(huán)化形成的，ATP不僅是合成產(chǎn)物的原料，還要為細(xì)胞生長以及蛋白質(zhì)、核酸、脂肪等的合成提供能量[4]，cAMP合成也常常受到能量供應(yīng)制約。另一方面，由從頭合成途徑合成嘌呤環(huán)的過程要經(jīng)過10步反應(yīng)，消耗5分子的ATP，代謝過程復(fù)雜而且加劇了ATP供應(yīng)不足的問題。

檸檬酸鹽是一種常見的化學(xué)試劑，價(jià)格低廉，在微生物代謝中具有重要的調(diào)節(jié)作用。該物質(zhì)可以抑制磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活性，減少有機(jī)酸的合成，調(diào)節(jié)糖酵解途徑與磷酸戊糖途徑的代謝流，促進(jìn)肌苷、尿苷酸等物質(zhì)的合成[5-6]。更重要的是，檸檬酸鹽作為輔助能量物質(zhì)可以刺激以NAD+為輔酶的代謝反應(yīng)，加快NAD+合成NADH的過程，再通過電子呼吸鏈大量合成ATP[7-8]。另外，微生物的補(bǔ)救途徑[9]可以直接利用現(xiàn)成的嘌呤類物質(zhì)與PRPP一步反應(yīng)即可合成肌苷酸，進(jìn)而合成cAMP，相比于從頭合成途徑代謝效率得以提高，同時(shí)降低了ATP的消耗，這種合成方法具有明顯的優(yōu)勢(shì)[10]。

該研究針對(duì)cAMP發(fā)酵過程中能量供應(yīng)不足的問題，試圖將檸檬酸鹽的作用與補(bǔ)救途徑的優(yōu)勢(shì)相結(jié)合促進(jìn)cAMP的合成，提出了檸檬酸鹽與次黃嘌呤偶聯(lián)添加發(fā)酵工藝，提高發(fā)酵性能。

1 材料與方法

1.1 菌種

本實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏的節(jié)桿菌(Arthrobactersp.A. sp01)。該菌株已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO. M2013431。

1.2 培養(yǎng)基及配制方法

斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨10，牛肉膏10，NaCl 3，尿素4，瓊脂20，調(diào)pH值至7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨10，牛肉膏10，NaCl 3，尿素4，酵母膏10，調(diào)pH值至7.2，121 ℃、高壓蒸汽滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖50，K2HPO410，KH2PO410，尿素10，生物素0.005，CoCl20.01，蛋白胨5，次黃嘌呤2，調(diào)pH值至7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.3 培養(yǎng)方法

搖瓶培養(yǎng)：30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基裝入250 mL錐形瓶，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。接入培養(yǎng)24 h種子液，接種量為10%體積百分濃度。接種后放入搖床培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速220 r/min。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：7 L機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐(上海保興生物設(shè)備有限公司BIOTECH-7BG)配備pH和DO電極各一支(瑞士METTLER TOLEDO公司)，裝載發(fā)酵培養(yǎng)基5 L(初始葡萄糖濃度為80 g/L)。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，接種量10%，發(fā)酵溫度30 ℃，pH值控制在6.8，攪拌轉(zhuǎn)速初始400 r/min，視溶氧變化情況逐漸增加至600 r/min，通風(fēng)量從起始的0.1 vvm提升至0.6 vvm。

次黃嘌呤添加方法：分批發(fā)酵進(jìn)行至27 h和40 h，分別脈沖式添加次黃嘌呤，每次添加量1 g/L-broth(發(fā)酵液中次黃嘌呤濃度提高1 g/L)。

檸檬酸鈉添加方法：

(a)發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵進(jìn)行至24 h一次性添加3 g/L-broth的檸檬酸鈉。

(b)搖瓶實(shí)驗(yàn)，設(shè)置1、2、3、4和5 g/L-broth 5個(gè)不同的濃度梯度和0、18、30和42 h 4個(gè)不同的添加時(shí)間，共計(jì)20個(gè)不同組合，每個(gè)組合做3個(gè)平行試驗(yàn)。

1.4 分析方法

菌體濃度測(cè)定：采用光密度法測(cè)定。發(fā)酵液稀釋20倍，用600 nm波長下的OD值表示菌體濃度。

菌體干重測(cè)定：參見文獻(xiàn)[11]，最終得到菌體干重與OD600的關(guān)系為：DCW/(g·L-1)=0.46×OD600

葡萄糖濃度測(cè)定：采用DNS法進(jìn)行測(cè)定。

cAMP與次黃嘌呤測(cè)定：使用高效液相色譜(安捷倫1026)進(jìn)行測(cè)定[12]。

ATP與ADP測(cè)定方法：取5 mL發(fā)酵液，4 ℃、9 000 r/min冷凍離心10 min獲得菌體，液氮中處理1 min，使胞內(nèi)代謝瞬間停止。將菌體用PBS緩沖液洗滌2次，重新懸浮在5 mL的PBS緩沖液中，冰浴條件下超聲波破碎10 min，超聲3 s，靜置5 s，經(jīng)4 ℃、10 000 r/min離心后，上清液用0.22 μm膜過濾后使用液相色譜分析。色譜條件：Lichrospher C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫30 ℃；水相(6.8 g KH2PO4和3.2 g四丁基溴化銨溶解于水并定容至1 L，用H3PO4調(diào)pH至4.3)，水相∶乙腈為85∶15(體積比)，流量0.8 mL/min；檢測(cè)波長258 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 檸檬酸鈉最佳添加時(shí)間與添加量的確定

研究表明，檸檬酸鹽能改變糖酵解與磷酸戊糖途徑的碳流量分配比例并可以作為輔助能源使用提高細(xì)胞產(chǎn)能水平，有利于核苷類物質(zhì)的合成[5-6]。在250 mL錐形瓶中進(jìn)行了添加檸檬酸鈉的cAMP發(fā)酵試驗(yàn)，共設(shè)置5個(gè)濃度梯度和4個(gè)不同添加時(shí)間，以cAMP產(chǎn)量為主要指標(biāo)確定最佳添加時(shí)間和添加量。如表1所示，30 h添加3 g/L-broth檸檬酸鈉時(shí)產(chǎn)物濃度達(dá)到最高的2.67 g/L，比對(duì)照提高了54.3%。

表1 檸檬酸鈉添加時(shí)間和添加量對(duì)cAMP發(fā)酵產(chǎn)物的影響Table 1 The effects of citrate sodium on cAMP productionwith different addition time and amounts

注：表中數(shù)據(jù)單位為g/L。

2.2 添加檸檬酸鈉提高cAMP發(fā)酵的整體性能

根據(jù)搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果并充分考慮發(fā)酵罐培養(yǎng)溶氧效果好、菌體生長快的特點(diǎn)，在7 L發(fā)酵罐上進(jìn)行了添加檸檬酸鈉的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，檸檬酸鈉的添加時(shí)間為24 h，添加量為3 g/L-broth。圖1將對(duì)照批次與添加檸檬酸的批次的主要參數(shù)進(jìn)行了比較。如圖1(A, B)所示，添加檸檬酸鈉批次的cAMP濃度在發(fā)酵50 h時(shí)達(dá)到最大值3.68 g/L，而對(duì)照批次發(fā)酵72 h時(shí)cAMP濃度為3.32 g/L；產(chǎn)量僅提高了11.2%，然而由于發(fā)酵時(shí)間縮短了22 h，生產(chǎn)效率提高了60.2%。此外，檸檬酸鈉添加提高了菌體濃度、葡萄糖消耗以及cAMP合成速率，如圖1-A、圖1-C和圖1-D所示。值得注意的是，次黃嘌呤在發(fā)酵前期快速消耗，至發(fā)酵27 h時(shí)降至0.4 g/L以下，不再變化(圖1-B)。

這表明發(fā)酵進(jìn)行至27 h后，cAMP是由從頭合成途徑合成并積累的，檸檬酸鈉添加顯著提高了從頭合成途徑的代謝通量，促進(jìn)了產(chǎn)物的快速合成。

2.3 檸檬酸鈉添加促進(jìn)ATP合成提高ATP/ADP比

研究表明檸檬酸鹽可以促進(jìn)能量代謝，是一種有效的輔助能量物質(zhì)[7]。對(duì)上述2個(gè)發(fā)酵批次不同時(shí)期的胞內(nèi)ATP和ADP含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見圖2。

A：■/□菌體濃度，●/○葡萄糖濃度；B：▲/△ cAMP濃度，◆/◇次黃嘌呤濃度；黑色符號(hào)：對(duì)照批次；白色符號(hào)：24 h添加3 g/L-broth檸檬酸鈉；C、D：——對(duì)照批次；---24 h添加3 g/L-broth檸檬酸鈉；↓表示檸檬酸添加時(shí)間圖1 檸檬酸鈉添加對(duì)菌體生長、殘?zhí)?、產(chǎn)物合成及前體利用的影響Fig.1 The effects of citrate sodium on cAMP fermentation performance

添加檸檬酸鈉批次的胞內(nèi)ATP含量得到顯著提高，ATP/ADP比率也大幅提高；尤其在24 h后，ATP含量和ATP/ADP比率迅速上升，至40 h左右達(dá)到最高點(diǎn)，此時(shí)正是cAMP快速合成、葡萄糖快速消耗的時(shí)期。這表明檸檬酸鈉促進(jìn)了ATP的合成，為cAMP的合成提供了充足的原料。

●-對(duì)照；○-24 h添加3 g/L-broth檸檬酸鈉圖2 檸檬酸鈉添加對(duì)ATP合成及ATP/ADP比的影響Fig.2 The effects of citrate sodium on ATP synthesis and ATP/ADP ratio

2.4 脈沖式補(bǔ)充次黃嘌呤偶合檸檬酸鈉添加的cAMP發(fā)酵工藝的整體性能

除從頭合成途徑外，微生物還可以直接利用環(huán)境中現(xiàn)有的嘌呤類物質(zhì)合成肌苷酸(補(bǔ)救途徑)，進(jìn)而合成cAMP。補(bǔ)救途徑通過一步反應(yīng)即可完成從頭合成途徑的10步反應(yīng)，節(jié)省了5分子ATP，代謝過程效率更高。希望將補(bǔ)救途徑的優(yōu)勢(shì)與檸檬酸鈉的作用相結(jié)合，進(jìn)一步提高cAMP的生產(chǎn)效率。因此，進(jìn)行了脈沖式補(bǔ)充次黃嘌呤偶合檸檬酸鈉添加的cAMP發(fā)酵試驗(yàn)。如圖3所示，偶合添加檸檬酸鈉批次的菌體濃度和cAMP產(chǎn)量均明顯提高，cAMP濃度在50 h達(dá)到最大的4.42 g/L，生產(chǎn)效率達(dá)到0.088 g/(L·h)，與單獨(dú)添加次黃嘌呤批次相比分別提高了38.1%和40.2%，大大提高了補(bǔ)救途徑的運(yùn)行效率。

另外，由圖3B中次黃嘌呤濃度的變化情況也表明添加檸檬酸鈉確實(shí)促進(jìn)了次黃嘌呤的吸收，提高了次黃嘌呤的利用效率。

■/□：菌體濃度；●/○：葡萄糖濃度；▲/△：cAMP濃度；◆/◇：次黃嘌呤濃度；黑色符號(hào)：27、38 h各補(bǔ)充g/L-broth次黃嘌呤；白色符號(hào)：24 h添加3 g/L-broth檸檬酸鈉，27、38 h各補(bǔ)充1 g/L-broth次黃嘌呤圖3 檸檬酸鈉與次黃嘌呤偶聯(lián)添加工藝中菌體、殘?zhí)?、產(chǎn)物及前體濃度的變化情況Fig.3 The fermentation performance for cAMP production with citrate sodium and hypoxanthine addition

2.5 不同發(fā)酵模式下主要發(fā)酵參數(shù)比較

表2對(duì)不同工藝條件下各發(fā)酵批次的主要參數(shù)進(jìn)行了比較。如表2所示，添加檸檬酸鈉或次黃嘌呤批次的發(fā)酵周期均不同程度的縮短，cAMP產(chǎn)量和發(fā)酵強(qiáng)度均不同程度的提高；24 h加檸檬酸鈉并脈沖補(bǔ)充次黃嘌呤批次的cAMP產(chǎn)量為4.42 g/L，發(fā)酵強(qiáng)度達(dá)到0.088 g/(L·h)，比對(duì)照分別提高了33.1%和91.3%。所有添加檸檬酸批次的cAMP產(chǎn)量、發(fā)酵強(qiáng)度均有一定程度的提高，特別是同時(shí)補(bǔ)充次黃嘌呤的批次提高幅度更大，使檸檬酸鈉的作用與補(bǔ)救途徑優(yōu)勢(shì)同時(shí)得到發(fā)揮。

表2 不同發(fā)酵批次的性能參數(shù)比較Table 2 Performance comparison for different fermentation modes

注：HX代表添加次黃嘌呤，C代表添加檸檬酸鈉；24 h表示添加檸檬酸鈉的時(shí)間；次黃嘌呤添加方式：27、38 h各補(bǔ)充1 g/L-broth次黃嘌呤

3 結(jié)論

添加檸檬酸鈉有利于提高cAMP發(fā)酵的整體性能，24 h一次性添加3 g/L-broth的檸檬酸鈉，cAMP濃度和生產(chǎn)效率分別比對(duì)照提高了11.2%和60.2%；對(duì)胞內(nèi)能量物質(zhì)含量進(jìn)行分析，結(jié)果表明添加檸檬酸鈉顯著提高了ATP含量和ATP/ADP比率，為cAMP合成提供了能量和物質(zhì)保障。提出了添加檸檬酸鈉偶合脈沖補(bǔ)充次黃嘌呤(前體)的發(fā)酵工藝，將能量供給與補(bǔ)救途徑的優(yōu)勢(shì)相結(jié)合，cAMP產(chǎn)量和發(fā)酵強(qiáng)度分別比對(duì)照提高了33.1%和91.3%。