張倩倩 孟現(xiàn)廣 黃淑紅 黨寧寧

惡性黑素瘤是一種來源于黑素細胞的惡性腫瘤，其中95%的黑素瘤發(fā)生在皮膚，而 5%則是發(fā)生在如黏膜、眼睛等非皮膚部位[1]。雖然皮膚黑素瘤約占皮膚惡性腫瘤的4%，但死亡率卻占惡性腫瘤死亡率的80%[2]。近年來，黑素瘤的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)增長趨勢，我國每年就有約2萬黑素瘤新發(fā)病例[3]。因此，黑素瘤的早期診斷和治療越來越成為人們研究的熱點。

Bafetinib(INNO-406)是一種有效的雙重Bcr-Lyn抑制劑，可誘導慢性粒細胞白血病(CML)細胞的凋亡[4]。Lyn又稱JTK8，是非受體型蛋白酪氨酸激酶SRC家族激酶(SFKs)中的一員，通過催化ATP上γ-磷酸轉移到某些底物蛋白酪氨酸殘基上，使得該蛋白質(zhì)酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，從而將細胞外信號轉入細胞內(nèi)，參與細胞的生長、發(fā)育、分化、遷移等過程。同時，Lyn也與一些疾病尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系。既往研究表明Lyn在白血病、腎癌、頭頸部鱗癌等多種腫瘤中表達量增加，并且腫瘤的發(fā)生發(fā)展與Lyn的活性密切相關，而前期實驗中我們發(fā)現(xiàn)，Lyn在黑素瘤中高表達。因此我們希望通過研究Bafetinib是否能夠抑制黑素瘤細胞UACC62中Lyn的表達，進而對其增殖和凋亡產(chǎn)生影響，來尋找新的治療黑素瘤的藥物。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 人惡性黑素瘤細胞株UACC62購自中國醫(yī)學科學院腫瘤細胞庫。培養(yǎng)液DMEM和胎牛血清購自美國Gibco公司，Lyn抑制劑Bafetinib購自美國MCE公司，CCK-8試劑購自北京Solarbio公司，RIPA裂解液、蛋白抽提試劑購自北京康為世紀生物科技公司。鼠抗人Lyn單克隆抗體購自美國Thermo Fisher公司，鼠抗人P-ERK、Bax、Beclin、Bcl-2單克隆抗體和鼠抗人GAPDH克隆抗體均購自美國Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) UACC62細胞培養(yǎng)在完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清的DMEM)中，并置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，根據(jù)生長速度每2～3天傳代1次，取對數(shù)生長期的細胞用于本實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測不同濃度的Bafetinib對人黑素瘤細胞UACC62的細胞活力及增殖速度的影響 取對數(shù)生長期的UACC62細胞，胰酶消化后調(diào)整細胞濃度，以1×103/L密度接種于96孔板，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄去原有培養(yǎng)基，分別加入含以下濃度Bafetinib的培養(yǎng)液：0.05、0.1、1、10、20、50、100、500 μmol/L各100 μL，每個濃度設立3個復孔。建立對照組，對照組中只加入100 μL的完全培養(yǎng)液。將實驗組和對照組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔中各加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育1 h，酶標儀測定450 nm處光密度(OD)值。同上方法鋪好96孔板后，一組細胞加入合適濃度Bafetinib的培養(yǎng)基100 μL作為實驗組，另一組只加入100 μL的完全培養(yǎng)液作為對照組，測0、24、48、72 h的OD值，繪制生長曲線圖。

1.2.3 克隆形成實驗檢測Bafetinib對人黑素瘤細胞UACC62增殖能力的影響 取對數(shù)生長期的UACC62細胞，胰酶消化后成單細胞懸液。將約500個細胞接種到含有5 mL培養(yǎng)基的10 cm培養(yǎng)皿中。用10 μmol/L的Bafetinib處理細胞作為實驗組，未加藥的正常細胞作為對照組，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，直到細胞形成肉眼可見的克隆團。然后棄去培養(yǎng)基，用PBS溶液清洗2～3次，5 mL 4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色30 min，最后用自來水沖洗后室溫晾干。計數(shù)克隆細胞團，并與對照組的大小和數(shù)量進行比較。

1.2.4 Western blot檢測Lyn、p-ERK、Bax、Beclin、Bcl-2蛋白的表達 收集實驗組和對照組的細胞，加入細胞裂解液，提取總蛋白，并進行蛋白濃度的測定，每組各取等量的蛋白(20～30 μg)進行SDS-PAGE電泳，PVDF轉膜，5%脫脂牛奶封閉，分別加入鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1∶3000)、鼠抗人P-ERK抗體(1∶1000)、鼠抗人Beclin抗體(1∶1000)、鼠抗人Bax抗體(1∶1000)、鼠抗人Bcl-2抗體(1∶1000)、鼠抗人Lyn抗體(1∶500)，4℃孵育過夜，TBST洗膜10 min×3次。再分別加入相應的二抗(1∶3000)室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，進行ECL顯影。應用ImageJ軟件，通過與內(nèi)參GAPDH灰度的比值，對Lyn、P-ERK、Bax、Beclin、Bcl-2蛋白進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 使用GraphPad Prism 5軟件分析，數(shù)據(jù)分析采用t檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 Bafetinib對黑素瘤細胞UACC62的細胞活力的影響 CCK-8實驗顯示：當Bafetinib濃度<1μmol/L時，對黑素瘤細胞UACC62的細胞活力無明顯影響；當Bafetinib濃度在1～50 μmol/L時，明顯抑制了黑素瘤細胞UACC62的細胞活力，且呈劑量依賴性；當Bafetinib濃度>50 μmol/L時，對細胞活力的抑制作用最大，提示Bafetinib已達到黑素瘤細胞UACC62的最大致死量(P<0.05)。見圖1。

2.2 Bafetinib能夠抑制黑素瘤細胞UACC62的增殖 CCK-8實驗顯示：與正常對照組相比，當UACC62細胞經(jīng)過濃度為10 μmol/L Bafetinib處理后，其OD值明顯增高(P<0.05)(圖2a)；克隆形成實驗結果顯示：與正常對照組相比較，當UACC62細胞經(jīng)過濃度為10 μmol/L Bafetinib處理后，細胞的克隆形成能力受到明顯抑制(P<0.05)。見圖2b、2c。

2.3 Bafetinib能夠有效降低UACC62細胞中Lyn的表達，并通過抑制ERK信號通路，促進細胞凋亡 Western blot結果顯示：與對照組相比，當濃度為10 μmol/L Bafetinib處理后實驗組細胞的Lyn、P-ERK表達水平明顯降低，提示Bafetinib能夠有效降低Lyn的表達，并能夠抑制ERK信號通路；同時促凋亡蛋白Bax、Beclin1的表達上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達下調(diào)(P<0.05)。見圖3a、3b。

圖1 不同濃度的Bafetinib對黑素瘤細胞UACC62細胞活力的影響* vs對照組，P<0.05；** vs對照組，P<0.01圖2 CCK-8實驗和克隆形成實驗檢測Bafetinib對黑素瘤細胞UACC62增殖能力的影響*vs對照組，P<0.05

圖3 Bafetinib通過ERK信號通路誘導黑素瘤細胞UACC62的凋亡 *vs對照組，P<0.05

3 討論

黑素瘤的發(fā)病機制相當復雜，早期診斷和治療仍面臨著很多挑戰(zhàn)。雖然目前臨床上治療黑素瘤的藥物有達卡巴嗪、伊匹單抗(ipilimumab)、達拉非尼(dabrafenib) 、維羅非尼(vemurafenib)和曲美替尼(trametinib)等，但是仍然存在一些安全性問題[5]。Bafetinib作為一種抗腫瘤新藥，已有研究證實其對白血病細胞有抑制增殖及促進凋亡的作用；同時對腦腫瘤細胞也有一定的抑制作用[6]。另有研究表明Bafetinib可以抑制ABCB1和ABCG2轉運蛋白介導的多藥耐藥性[7]。新的研究發(fā)現(xiàn)Bafetinib可以抑制PAR2-TrPV4偶聯(lián)，減少機械性痛覺過敏，達到鎮(zhèn)痛效果[8]；還能夠抑制嗜酸粒細胞反應，在抗過敏治療中可能起著輔助作用[9]。但Bafetinib在黑素瘤中的作用尚無研究，因此，我們希望通過研究Lyn抑制劑Bafetinib對惡性黑素瘤細胞UACC62增殖和凋亡的影響，初步了解Bafetinib在惡性黑素瘤的作用機制，從而為黑素瘤的治療提供一個新方向。

本實驗中，我們用不同濃度的Bafetinib處理黑素瘤細胞株UACC62后，通過CCK-8實驗檢測各組細胞的細胞活力，發(fā)現(xiàn)當Bafetinib濃度<1 μmol/L時，實驗組的細胞活力與對照組無明顯差異；當Bafetinib濃度在1～50 μmol/L時，實驗組的細胞活力較對照組顯著降低(P<0.05)，且細胞活力隨著Bafetinib濃度的增加而降低；當Bafetinib濃度>50 μmol/L，實驗組的細胞活力較對照組顯著降低，但細胞活力并未隨著Bafetinib濃度的增加而降低。這些提示Bafetinib抑制黑素瘤細胞UACC62的生長需要一定的濃度，并且在一定濃度范圍內(nèi)(1～50 μmol/L)，黑素瘤細胞株UACC62的細胞活力隨著Bafetinib濃度的增加而降低，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，但并非濃度越高，抑制作用越強，當Bafetinib濃度達到50 μmol/L時，對細胞活力的抑制作用最大，即達到黑素瘤細胞UACC62的最大致死量。CCK-8和克隆形成實驗表明：Bafetinib能夠抑制黑素瘤細胞UACC62的增殖。為進一步研究Bafetinib對黑素瘤細胞UACC62信號通路及凋亡的影響，我們應用Western blot，結果顯示：與對照組相比，用Bafetinib處理的細胞其Lyn的表達量明顯降低，表明Bafetinib可以有效抑制Lyn的表達；P-ERK的表達量明顯降低，即ERK的磷酸化水平被抑制，提示Bafetinib能夠抑制ERK信號通路的活化；同時抗凋亡蛋白Bcl-2的表達量明顯降低，而促凋亡蛋白Bax、Beclin1的表達量明顯增加，提示Bafetinib能夠誘導黑素瘤細胞凋亡。這些結果均表明，Lyn抑制劑Bafetinib可以影響黑素瘤細胞UACC62的增殖和凋亡，并且是通過抑制ERK信號通路的活化發(fā)揮其抑制細胞生長的作用，但具體的作用機制還需進一步的研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，Lyn抑制劑Bafetinib能夠有效降低黑素瘤細胞UACC62中Lyn的表達，抑制細胞的增殖能力，并通過抑制ERK信號通路的活化，誘導其凋亡，從而為Bafetinib抗黑素瘤研究提供了依據(jù)。