鄔清芝 孫 毅 曾同祥

孢子絲菌病是一種亞急性或慢性的皮下組織真菌病，是由申克孢子絲菌復(fù)合體(sporothrix schenckii complex)引起的皮膚、皮下組織及淋巴系統(tǒng)的亞急性和慢性感染[1]?？赏ㄟ^有創(chuàng)傷的皮膚或開放性損傷的組織感染進(jìn)行傳播，也可經(jīng)過人體的呼吸道吸入分生孢子導(dǎo)致肺部感染。孢子絲菌病分為皮膚型和皮膚外型，皮膚型又可分為皮膚固定型、皮膚淋巴管型、皮膚播散型。是皮膚科最常見的感染性肉芽腫性疾病之一，也是最常見的皮下組織真菌病[2,3]。傳統(tǒng)的診斷方法主要根據(jù)直接鏡檢、真菌培養(yǎng)及鑒定可明確致病菌種，還可以提供藥物敏感性測試結(jié)果，但耗時(shí)較長，分子生物學(xué)診斷不僅可用于培養(yǎng)菌落的菌種鑒定，還可以用于病變組織的診斷，可縮短診斷時(shí)間，明確菌種但后者無法提供藥物敏感性結(jié)果，因而不同方法各有利弊[4-6]。本文3例結(jié)合了活檢組織直接分子診斷和傳統(tǒng)真菌病原學(xué)檢測方法，早期診斷，并進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)性抗真菌治療，真菌培養(yǎng)及藥敏進(jìn)一步證實(shí)致病菌種及藥物敏感性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患者1，男，60歲，農(nóng)民。因左手背皮損1年余來我院就診。1年前左手背出現(xiàn)黃豆大皮損，逐漸擴(kuò)大，曾口服頭孢類藥物和外用多種抗生素軟膏治療無效。否認(rèn)特殊病史；皮膚科檢查：左手背可見一處2 cm×1 cm暗紅色斑塊，質(zhì)軟，境界清楚，表面有膿痂(圖1a)；輔助檢查：三大常規(guī)、肝腎功能、血糖血脂無異常。

患者2，女, 45歲，農(nóng)民。因右手背皮損1年來我院就診。1年前右手背出現(xiàn)黃豆大皮損，逐漸擴(kuò)大，曾在外院口服美滿霉素、頭孢類藥物治療無效；否認(rèn)特殊病史。皮膚科檢查：右手背見一3 cm×3 cm紅色斑塊，質(zhì)軟，境界清楚，表面有破潰、膿液外滲及結(jié)痂(圖1b)；輔助檢查：三大常規(guī)、肝腎功能、血糖血脂無異常。

患者3，女,58歲，農(nóng)民。因左手背及上肢皮損半年余來我院就診?；颊甙肽甓嗲埃笫种兄赋霈F(xiàn)黃豆大皮損，逐漸擴(kuò)大，并蔓延至手背、前臂及上臂，曾在外院口服、靜脈滴注頭孢類藥物，及多種中草藥外敷治療無效；高血壓病3年，口服藥物控制；否認(rèn)其他特殊病史。皮膚科檢查：左手中指指背、手背及前臂均可見1 cm×1 cm～3 cm×1 cm紅色斑塊，境界清楚，表面有破潰、膿液外滲及結(jié)痂，左上臂可見一1.5 cm×1 cm暗紅色結(jié)節(jié)；輔助檢查：三大常規(guī)、肝腎功能、血糖血脂無異常。

1.2 實(shí)驗(yàn)室檢查

1.2.1 直接鏡檢及培養(yǎng) 真菌直接鏡檢；將皮屑及膿液利用10% KOH直接鏡檢，見少量孢子、未找到菌絲(圖1c、d)；將收集的膿液和皮屑接種于沙氏培養(yǎng)基(含卡那霉素)中，置于27℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 活檢組織分子鑒定 取部分活檢組織于1.5 mL離心管中，加入250 μL DNA提取液及少量玻璃珠于漩渦震蕩儀2000 r/min震蕩10 min 后，14000 r/min離心10 min并收集上清；采用EasyPure Plant Genomic DNA Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司)提取DNA，方法參考試劑盒說明書；然后PCR擴(kuò)增：擴(kuò)增引物ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’[7]擴(kuò)增所提取真菌DNA的ITS區(qū)；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行測序，測序結(jié)果登錄GeneBank進(jìn)行Blast比對；比對結(jié)果提示申克孢子絲菌。

1.2.3 組織病理學(xué)檢查 對3例患者病變部行組織病理檢查，石蠟切片，HE染色，3例病理學(xué)特征均為感染性肉芽腫(圖2a、b)；抗酸染色及PAS染色陰性。

1.2.4 真菌培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)鑒定 3例患者的膿液及組織培養(yǎng)1周后均可見菌落生長，轉(zhuǎn)種于察氏瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)行形態(tài)學(xué)觀察，并進(jìn)行小培養(yǎng)形態(tài)學(xué)觀察(圖3)。

a：病例1皮損：左手背可見一2 cm×1 cm暗紅色斑塊，質(zhì)軟，境界清楚，表面有膿痂；b：病例2皮損：右手背可見一3 cm×3 cm紅色斑塊，質(zhì)軟，境界清楚，表面有破潰、膿液外滲及結(jié)痂；c: 病例1皮損處皮屑及膿液直接鏡檢：僅見少量孢子(箭頭)，未見菌絲；d：病例2皮損處皮屑及膿液直接鏡檢：見少量孢子(箭頭)，未見菌絲

圖1 患者皮損臨床圖像及直接鏡檢圖像

圖2 患者組織病理圖像：病例1和2組織病理檢查(HE,×100)：a、b見彌漫混合型炎細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、組織細(xì)胞等)浸潤圖3 球形孢子絲菌形態(tài)學(xué)圖像：a：沙氏培養(yǎng)基 27℃ 恒溫培養(yǎng)，10天后可見有灰白色褶皺粉末狀菌落生長;b：見細(xì)長分隔菌絲，分生孢子延菌絲呈袖套樣排列(×400)

1.2.5 真菌DNA提取及分子鑒定 同時(shí)玻璃珠法分別提取菌株DNA，通過ITS鑒定仍提示申克孢子絲菌；為進(jìn)一步進(jìn)行種間鑒定，利用calmodulin基因擴(kuò)增引物CL1(5’-GA(GA)T(AT)CAAGGAGGCCTTCTC-3’)和CL2A(5’-TTTTTGCATCATGAGTTGGAC-3’)擴(kuò)增及測序鑒定；將測序所得的CAL原始序列于GeneBank中進(jìn)行比對，鑒定其為球形孢子絲菌。

1.2.6 藥物敏感性檢測 參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(clinical and laboratoty standards institute，CLSI)的M27-A3和M38-A2方案進(jìn)行[8,9]。質(zhì)控株為近平滑念珠菌ATCC 22019。測試藥物：伊曲康唑(sigma-aldrich，批號84625-61-6，純度>99%)、特比萘芬(sigma-aldrich，批號78628-80-5，純度>99%)及伏立康唑(sigma-aldrich，批號182369-73-9，純度>99%)。

1.2.7 糖同化實(shí)驗(yàn) 收集孢子懸液并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，菌懸液濃度為1×105～1×106CFU/mL；在YNB培養(yǎng)基中加入5%不同糖(葡萄糖、蔗糖、棉籽糖)；將孢子懸液加入含不同糖的YNB中，28℃孵育至第 5 天后培養(yǎng)基由澄清變?yōu)闇啙釀t說明同化試驗(yàn)陽性，如仍保持澄清則同化試驗(yàn)陰性[10]。三個(gè)受試菌株蔗糖同化試驗(yàn)陽性、棉籽糖同化試驗(yàn)陰性。

2 診斷與治療

該3例患者膿液中存在少量孢子，本文根據(jù)早期病變組織的分子診斷結(jié)果及臨床表現(xiàn)診斷為孢子絲菌病，給予患者特比萘芬口服250 mg/d；舍他康唑乳膏外用；早期的分子鑒定利用ITS測序?yàn)樯昕随咦咏z菌，與培養(yǎng)菌經(jīng)ITS測序鑒定結(jié)果相符。進(jìn)一步對calmodulin基因測序，發(fā)現(xiàn)為球形孢子絲菌；結(jié)合糖同化實(shí)驗(yàn)鑒定，最終證實(shí)為球形孢子絲菌。3株菌株體外藥敏試驗(yàn)顯示在菌絲相和酵母相時(shí)特比萘芬、伊曲康唑和伏立康唑的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)分別為0.125 μg/mL、1 μg/mL 和0.5 μg/mL；藥敏試驗(yàn)提示其對特比萘芬敏感。患者服藥期間均無任何不良反應(yīng)。復(fù)診時(shí)見患者皮損明顯好轉(zhuǎn)(圖4a、b)。提示病變組織的早期分子檢測可以早期診斷，指導(dǎo)治療。

a：病例1治療1個(gè)月后復(fù)診：左手背皮損大小較治療前好轉(zhuǎn)；b：病例2治療1個(gè)月左右復(fù)診：右手背皮損大小較治療前縮小

圖4 抗真菌治療后患者臨床圖像

3 討論

孢子絲菌病主要分布在熱帶和亞熱帶國家，也可以發(fā)生在溫帶國家，好發(fā)于農(nóng)林畜牧業(yè)人群。是皮膚科最常見感染性肉芽腫性疾病之一，也是最常見的皮下組織真菌病[1-3]。典型皮損表現(xiàn)為糜爛、潰瘍、浸潤斑塊或結(jié)節(jié)；當(dāng)感染孢子絲菌時(shí)由于宿主免疫力不同、皮損及發(fā)病部位不同、長期搔抓、自行外用不明藥物等因素可出現(xiàn)不典型皮損。診斷金標(biāo)準(zhǔn)仍是培養(yǎng)陽性[5]。

對于深部真菌感染傳統(tǒng)診斷方法主要包括鏡檢、培養(yǎng)及組織病理學(xué)檢查；直接鏡檢陽性率低，使用培養(yǎng)基進(jìn)行鑒定菌種耗時(shí)長，至少需要1～2周，給臨床診治帶來不便；組織病理學(xué)檢查不容易找到典型的真菌孢子，且不能準(zhǔn)確鑒定致病菌種[6]。而病變組織的直接分子鑒定能提早明確致病菌種并為經(jīng)驗(yàn)性治療用藥提供依據(jù)。本文3例患者由于鏡檢取膿液行直接鏡檢，見少量孢子，組織及膿液的培養(yǎng)需耗時(shí)1周；然而采用病變組織直接提取DNA鑒定在2天內(nèi)即可完成，大大縮短了臨床診療的進(jìn)程。

雖然分子診斷可以給臨床診治帶來便捷，但是目前孢子絲菌病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)仍是培養(yǎng)陽性，而且致病真菌對藥物敏感性的檢測也只能對培養(yǎng)獲得的純菌進(jìn)行。因此，對培養(yǎng)菌株的分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果仍是必要的，可與早期診斷獲得的結(jié)果相互驗(yàn)證。

臨床治療中，飽和碘化鉀溶液為治療孢子絲菌病的經(jīng)典藥物，但其潛在的副作用(如碘疹、胃腸道紊亂、甲狀腺抑制等)以及配制不方便等原因限制了臨床使用[11]；根據(jù)美國感染疾病學(xué)會發(fā)表的孢子絲菌病診療指南推薦伊曲康唑?yàn)橹委熸咦咏z菌病的首選藥物，其次為特比萘芬[12]；該3例球形孢子絲菌經(jīng)驗(yàn)性給予了特比萘芬口服250 mg/d治療；藥敏檢測時(shí)結(jié)果也提示菌株對特比萘芬敏感；經(jīng)隨訪，3例患者均獲得治愈。