，

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院心腦病科，四川 瀘州 646000)

出血性腦卒中是臨床常見的危急重癥，而腦出血后腦水腫是導(dǎo)致病情進(jìn)一步加重甚至死亡的關(guān)鍵因素[1]，其水腫的發(fā)生發(fā)展又與血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)的破壞與功能障礙密切相關(guān)。然而目前尚未發(fā)現(xiàn)具有調(diào)節(jié)BBB功能障礙的西藥，但已有研究發(fā)現(xiàn)芳香開竅類中藥對BBB通透性具有雙向調(diào)節(jié)作用[2]。本課題組繼承全國名老中醫(yī)王明杰的“玄府理論”學(xué)術(shù)思想，發(fā)現(xiàn)腦之玄府在結(jié)構(gòu)與功能上均與BBB具有著明顯的相關(guān)性[3]，但是尚不明確以開通玄府為法的風(fēng)藥組方是否如同芳香開竅藥對BBB仍具有雙向調(diào)節(jié)的作用，是否能雙向調(diào)節(jié)腦出血后BBB的功能障礙，從而減輕腦水腫。因此，本實驗在前期研究成果及臨床經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，擬定風(fēng)藥、蟲類藥組方以開通腦之玄府，研究開通玄府法對腦出血后BBB所具有雙向調(diào)節(jié)的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量270～320 g，由西南醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供(許可證號SCXK(川)2013-17)。

1.2 主要藥物及試劑

祛風(fēng)通竅方組成：麻黃 10 g，麝香0.1 g，水蛭3 g，地龍10 g，全蝎5 g，茯苓15 g，石菖蒲10 g。其中水蛭、地龍、全蝎經(jīng)醇化提取，石菖蒲提取揮發(fā)油，除麝香外全方藥味水煎并濃縮至2 g/ml，麝香研磨加入濃縮液。試劑：水合氯醛:Solarbio(批號421E021)；戊巴比妥鈉，由西南醫(yī)科大學(xué)藥理實驗室提供；0.5%伊文思藍(lán)(Evens blue):Solarbio(批號20170412)。

1.3 主要實驗儀器

大鼠腦立體定位儀，由西南醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)教研室提供；50 μl微量進(jìn)樣器，上海高鴿工貿(mào)有限公司；Multiskan FC 酶標(biāo)儀，Thermo；FA2204B電子天平，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司。

1.4 動物分組及給藥

將60只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、加減祛風(fēng)通竅方低、中、高劑量組(分別簡稱為“低劑量組”“中劑量組”“高劑量組”)每組各12只。大鼠造模前12 h灌胃1次，造模后每天灌胃1次，共灌胃7次。給藥劑量換算:大鼠的劑量(mg/kg)=折算系數(shù)(W=6.25)×人的劑量(mg/kg)，即低、中、高劑量組分別為2.77、5.53、11.06 g/kg·d-1。

1.5 動物造模及模型評估

大鼠術(shù)前禁食禁飲12 h，稱重后2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)、10%水合氯醛(200 mg/kg)分別腹腔麻醉，俯臥位固定于腦立體定位儀，頭部及尾部備皮消毒，沿頭皮正中縱行切開約1 cm，雙氧水腐蝕骨膜，參照《大鼠腦立體定位圖譜》[4]進(jìn)行尾殼核定位(前囟前0.2 mm，中線右側(cè)旁開3.0 mm處)，12號針頭鉆孔直徑約1 mm，暖水袋包裹鼠尾2～3 min，距鼠尾尖3～4 cm用10號刀片尖切斷尾動脈，微量進(jìn)樣器取不抗凝血50ul，針尖中點自鉆孔處顱骨表面進(jìn)5.5 mm，按20ul/min勻速注血，留針15 min緩慢退針，骨蠟封孔，縫合頭皮，青霉素8U腹腔注射。假手術(shù)組以生理鹽水代替自體血。參照Zea Longa[5]5分制法制定神經(jīng)功能缺損評分：無神經(jīng)功能缺損癥狀，記0分；提尾倒掛時血腫對側(cè)前肢緊貼胸壁或不能伸展，記1分；行走時向一側(cè)轉(zhuǎn)圈追尾,且血腫對側(cè)前肢長拖或蜷縮，或有上述1分癥狀伴側(cè)推時輕癱側(cè)抵抗力減弱，記2分；行走或站立時向血腫對側(cè)傾倒，記3分；意識障礙且不能行走，記4分，1～3分者為模型成功納入實驗。死亡大鼠及造模不成功大鼠隨機(jī)補(bǔ)充。

1.6 標(biāo)本采集

術(shù)后6 h、3 d、7 d 3個時點取各組內(nèi)4只大鼠，0.5%伊文思藍(lán)(6 ml/kg)經(jīng)尾靜脈注射見鞏膜及皮膚變藍(lán)，循環(huán)1 h后10%水合氯醛(40 mg/kg)腹腔麻醉，迅速開胸暴露心臟，用接有輸液器的磨鈍10號針頭與心尖左緣成 45°向上進(jìn)針，插送至主動脈起始部，止血鉗固定針頭，剪開右心耳，4 ℃生理鹽水100 ml快速滴注，并用止血鉗夾閉腹主動脈，至右心耳流出清澈液，改用4%多聚甲醛50 ml先快后慢滴注，待大鼠上肢及頸部明顯僵硬，斷頭器斷頭開顱取腦，在冰塊托盤內(nèi)進(jìn)行取材。

1.7 檢測伊文思藍(lán)含量(Evens blue，EB)反映血腦屏障通透性

圖1顯示，冠狀位切取針孔后約3 mm腦組織，沿矢正中線切分出血側(cè)與未出血側(cè)，稱重后放入組織勻漿器中，加入1.5 ml PBS液，將腦組織制成勻漿液，離心機(jī)4 ℃，2000 r/20 min，取上清1 ml加入1 ml 100%三氯乙酸，4 ℃孵育 24 h后，2000 gr/20 min。取上清液200 μl移入酶標(biāo)板，用酶標(biāo)儀測620 nm處吸光值(OD值)。EB標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：配置空白對照液(1 ml PBS液：1 ml 100%三氯乙酸)及EB標(biāo)準(zhǔn)液，微量移液器取0.5%伊文思藍(lán)0.1 ml加入0.4 ml空白對照液中配置成第一管液(1000 μg/ml)，取第一管液0.1 ml加入0.1 ml空白對照液配置成第二管液(500 μg/ml)，以此類推，每次稀釋2倍，至第十四管液(0.122 μg/ml)。選擇第九管至十四管液的OD值，繪制EB標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算每克腦組織EB含量，結(jié)果以 μg/g表示(與血腦屏障通透性呈正相關(guān))。

圖1 伊文思藍(lán)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線( μg/ml)

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損情況

造模后假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)功能缺損體征，模型組及各給藥組大鼠出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、攝食和自由活動減少及神經(jīng)功能缺損體征。大鼠造模清醒1 h后偏癱體征明顯，表現(xiàn)為左前肢蜷縮不能完全伸展或長拖，行走向一側(cè)轉(zhuǎn)圈或向偏癱側(cè)傾倒等。評分1分的大鼠，術(shù)后1～2 d偏癱體征穩(wěn)定后逐漸改善。模型組及低劑量組內(nèi)評分2～3分的大鼠，術(shù)后2～3 d偏癱體征加重，部分死亡，術(shù)后4 d后偏癱體征逐漸改善。與模型組比較，中、高劑量組大鼠自主活動恢復(fù)較快，神經(jīng)缺損癥狀較輕，大多數(shù)表現(xiàn)為左前肢不能完全伸展或長拖，無意識障礙及死亡。

2.2 出血側(cè)腦組織EB比較

表1顯示，與假手術(shù)組比較，模型組、低劑量組、中劑量組在各個時間點EB均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高劑量組在6 h、3 d時EB升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，低劑量組在6 h、3 d時EB降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，中、高劑量組在3個時點EB均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠腦出血側(cè)腦組織EB(μg/g)比較

注：與假手術(shù)組比較:aP<0.05；與模型組比較:bP<0.05；與低劑量組比較:cP<0.05；與中劑量組比較:dP<0.05

2.3 未出血側(cè)腦組織EB比較

表2顯示，與假手術(shù)組比較，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組在各個時間點EB均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，低、中劑量組在3 d時EB升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在7 d時EB降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，高劑量組在6 h、3 d時EB升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在7 d時EB降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠未出血側(cè)腦組織EB(μg/g)的比較

注：與假手術(shù)組比較:aP<0.05；與模型組比較:bP<0.05；與低劑量組比較:cP<0.05；與中劑量組比較:dP<0.05

3 討論

腦出血后腦水腫與BBB破壞[6]及其雙向調(diào)節(jié)功能障礙[7]密切相關(guān)，而BBB是位于腦組織和外周血液之間的復(fù)雜細(xì)胞結(jié)構(gòu)，能調(diào)節(jié)和保證大腦內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[7]。BBB損壞后，其雙向調(diào)節(jié)功能障礙會導(dǎo)致其通透性增加，水分容易進(jìn)入腦內(nèi)形成腦水腫。然而目前尚未發(fā)現(xiàn)具有改善BBB功能并調(diào)節(jié)其通透性的西藥，因此探究具有多靶點、多方面、整體調(diào)節(jié)改善BBB功能以減輕腦出血后腦水腫的中藥湯劑具有重要意義。

玄府起源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，亦有“汗空”“腠理”“氣門”“鬼門”等稱謂，金元醫(yī)家劉完素在《素問玄機(jī)原病式》中提出：“玄府者，無物不有，人之臟腑，皮毛，肌肉，筋膜，骨髓，爪甲，至于世之萬物，盡皆由之，乃氣出入升降之道路門戶也?！被谀壳靶碚摰闹T多研究，可以認(rèn)為玄府是遍布全身的最為細(xì)小的微觀結(jié)構(gòu)，而其所具有的廣泛性、微觀性、開闔性和通利性均與BBB結(jié)構(gòu)及功能有著明顯的相關(guān)性。從“玄府-血腦屏障”的角度對腦出血后腦水腫進(jìn)行中醫(yī)病機(jī)分析，腦中氣機(jī)逆亂是引發(fā)中風(fēng)病的始動因素，玄府失司、開闔失常是中風(fēng)病的基本病機(jī)，水瘀內(nèi)停、玄府郁閉是導(dǎo)致后期病情加重的重要因素。

導(dǎo)師白雪繼承全國名老中醫(yī)王明杰“玄府理論”學(xué)術(shù)思想，根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗，以風(fēng)藥、蟲類藥組方“祛風(fēng)通竅方[8]”論治腦病，并已獲得較多的科研成果。根據(jù)“玄府以通為用”“以通為順，以閉為逆”等原則，治以風(fēng)藥、蟲類藥開通玄府，則可減輕腦水腫。本實驗化裁上方重用麻黃治療腦出血，既源于玄府理論對麻黃的認(rèn)識，亦借鑒祛外風(fēng)藥治療中風(fēng)的經(jīng)驗，如小續(xù)命湯。

肖農(nóng)等[9]研究發(fā)現(xiàn)，麻黃堿可促進(jìn)腦缺血大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)多種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，提高參與神經(jīng)元重塑的蛋白分子表達(dá)；麝香具有改善腦循環(huán)及抗炎的作用，其組分麝香酮能可逆性下調(diào)緊密連接蛋白Claudins家族基因表達(dá)[10]，使緊密連接結(jié)構(gòu)疏松，開啟BBB；水蛭治療腦出血具有抗凝血酶、調(diào)節(jié)Claudin-5的表達(dá)[11]、改善BBB通透性的作用[12]。地龍能溶解體內(nèi)血栓、抗自由基、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞[13]；全蝎具有抗凝、抗氧化作用；茯苓具有抗氧化、抗炎作用。吳啟端等[14]發(fā)現(xiàn)，石菖蒲揮發(fā)油、β-細(xì)辛醚能明顯提高BBB通透性,從而提高腦部的藥物濃度。

實驗結(jié)果顯示，加減祛風(fēng)通竅方能降低腦出血后出血側(cè)BBB通透性，抑制腦水腫加重，并存在一定的量效關(guān)系。從現(xiàn)代藥理研究分析，可能與麻黃、水蛭、地龍、全蝎抗凝血作用減少凝血酶的產(chǎn)生，減少基質(zhì)金屬蛋白酶激活，抗氧化、減少自由基的產(chǎn)生有關(guān)，亦與水蛭素提高緊密連接相關(guān)蛋白Claudin-5的表達(dá)，改善BBB的作用有關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)，腦出血后未出血側(cè)的BBB通透性亦會升高，可能是腦出血后大量自由基、血管活性物質(zhì)等循環(huán)到未出血側(cè)腦組織導(dǎo)致的。此方能夠使未出血側(cè)BBB通透性在腦出血后的某段時期進(jìn)一步升高，可能與石菖蒲、麝香酮下調(diào)Claudins蛋白的表達(dá)，致使緊密連接結(jié)構(gòu)疏松、提高BBB通透性有關(guān)。因此，風(fēng)藥、蟲類藥組方開通玄府對腦出血后BBB具有雙向調(diào)節(jié)作用，即一方面能降低病理性BBB通透性，另一方面能夠使未出血側(cè)BBB通透性在腦出血后某段時期進(jìn)一步升高，但其開放作用可能屬于病理狀態(tài)與藥理作用的共同結(jié)果。此開放作用能否促進(jìn)藥物進(jìn)入腦組織以增強(qiáng)療效，以及此雙向調(diào)節(jié)作用是否與水蛭素、石菖蒲、麝香酮的“相反作用”有關(guān)，均需今后深入研究。