朱偉軍，雷軍榮，白曉君，王蕊，葉玉蘭，鮑建軍

（1.陜西省西安高新醫(yī)院 心內(nèi)科，陜西 西安 710075；2.陜西省西安高新醫(yī)院 心胸外科，陜西 西安 710075；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科，陜西 西安 710061）

動脈粥樣硬化是造成死亡和殘疾的主要原因，也是缺血性卒中和高血壓的主要誘因之一。而內(nèi)皮細(xì)胞的增殖是斑塊形成的重要機(jī)制，此外，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡也是動脈粥樣硬化發(fā)展過程中至關(guān)重要的因素。因此，探討影響血管平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)的分子對于預(yù)防或治療血管增生性疾病具有重要的意義。MicroRNA（miRNA）是一類干擾轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后過程的非編碼小RNA家族[1]。miRNA在心血管疾病包括心肌缺氧復(fù)氧損傷、心肌肥厚、心律失常以及心力衰竭等過程中具有重要的作用[2]。miR-200c是miR-200基因家族的成員之一，和miR-141都聚集在12號染色體。前期的研究發(fā)現(xiàn)[3]，過氧化氫H2O2刺激可上調(diào)miR-200c在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)水平，且上調(diào)的miR-200c可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、凋亡。本研究通過制備氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）損傷的人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞（HAEC）模型，研究miR-200c對Ox-LDL誘導(dǎo)的HAEC損傷的作用及相關(guān)機(jī)制，為動脈粥樣硬化的治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

HAEC和內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國ATCC公司，轉(zhuǎn)染試劑盒LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，RNA提取試劑盒miRNeasy Mini Kit購自德國Qiagen公司，Taq Man miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國ABI公司，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自中國碧云天公司，兔抗EphA2多克隆抗體、HRP標(biāo)記的?？雇枚官徸悦绹鳶anta Cruz公司。Applied Biosystems 7500實時聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

將HAECs接種于含內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、5%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中。置于37℃含5% CO2和95%空氣的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞長至80%匯合時，將培養(yǎng)基換成含不同濃度（0、30、60 μg/ml）Ox-LDL的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，選擇30 μg/ml濃度的 Ox-LDL分別培養(yǎng) 0、12、24、48 h。

1.3 轉(zhuǎn)染

將胰酶消化的HAECs以2×105個/孔的濃度接種于6孔培養(yǎng)箱中，根據(jù)LipofectamineTM2000試劑盒說明書將miR-200c inhibitor（In-miR-200c）及其陰性對照（NC組）或Slit2及對應(yīng)陰性對照（Sham組）轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞檢測miR-200c和Slit2表達(dá)水平或進(jìn)一步進(jìn)行Ox-LDL處理，未進(jìn)行任何處理的細(xì)胞為對照組（CON組）。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）

收集細(xì)胞，采用miRNeasy Mini Kit試劑盒提取總RNA，Taq Man miRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，隨后使用Applied Biosystems 7500實時PCR系統(tǒng)進(jìn)行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）。PCR反 應(yīng) 條 件 為 ：95℃10 min，40個周期的95℃ 15 s和60℃ 60 s，以U6為內(nèi)參。

1.5 MTT法

將miR-200c和Ox-LDL處理的細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)0、12、24、48、72 h分別向每孔中加入20 ml的MTT，繼續(xù)孵育4 h后，加入150 ml DMSO振蕩使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀上測定490 nm處吸光度值。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測

采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡情況。收集細(xì)胞并以1×106個/ml濃度進(jìn)行重懸浮。取500 μl細(xì)胞懸液加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI溶液，然后在室溫下避光孵育15 min。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測定。

1.7 Western blot檢測

將細(xì)胞置于含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液中進(jìn)行裂解。離心后，收集上清液并對獲得的蛋白進(jìn)行定量。取適量蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳并分離，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。經(jīng)5%脫脂乳封閉1 h后，將膜分別與Slit2一抗和HRP標(biāo)記的二抗孵育。用奧德賽成像系統(tǒng)對條帶進(jìn)行掃描。

1.8 熒光素酶檢測

將含有Slit2野生型（WT）或突變（MUT）3'-UTR的基因序列構(gòu)建到psi-check2熒光素酶報告基因質(zhì)粒載體（美國Promega公司）。然后，將HAEC接種于24孔板，并加入0.5 mg miR-200c inhibitor或陰性對照質(zhì)粒用脂質(zhì)體2000試劑進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒的熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析和重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-200c在經(jīng)Ox-LDL干預(yù)的HAEC中的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，30和60 μg/ml Ox-LDL處理組miR-200c表達(dá)為（2.25±0.23）和（3.35±0.15），與0 μg/ml Ox-LDL處理組（1.00±0.10）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=145.700，P=0.000）；30 μg/ml Ox-LDL 12、24和48 h處理組miR-200c表達(dá)為（1.85±0.19）、（2.71±0.25）和（4.62±0.38），與0 h處理組（1.00±0.12）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=110.6，P=0.000）。見圖1。

2.2 沉默miR-200c上調(diào)細(xì)胞生存活性

圖1 miR-200c在經(jīng)Ox-LDL干預(yù)的HAEC中的表達(dá)

經(jīng)miR-200c inhibitor轉(zhuǎn)染后miR-200c表達(dá)沉默，CON組miR-200c的相對表達(dá)為（1.00±0.15），NC組為（1.05±0.10），In-miR-200c組為（0.23±0.04）（見圖2A）。CON組、Ox-LDL組及Ox-LDL+In-miR-200c轉(zhuǎn)染組。12、24、48、72 h吸光度值比較，結(jié)果：①不同時間點的吸光度值有差異（F=234.37，P=0.000）；②3組吸光度值有差異（F=13.259，P=0.006），Ox-LDL組吸光度值較低；③3組吸光度值變化趨勢有差異（F=88.172，P=0.000）。見圖2B和附表。

2.3 過表達(dá)miR-200c抑制細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，Ox-LDL組細(xì)胞凋亡水平高于CON組（t=-37.836，P=0.000）。而與Ox-LDL組比較，Ox-LDL+In-miR-200c組細(xì)胞凋亡水平下降（t=16.362，P=0.000）（見圖3A）。此外，對Caspase-3的檢測也發(fā)現(xiàn)，與CON組比較，Ox-LDL組Caspase-3活性升高（t=-9.275，P=0.001），且高于 Ox-LDL+In-miR-200c組（t=5.517，P=0.005）（見圖 3B）。

2.4 miR-200c靶向抑制Slit2表達(dá)

通過檢索microRNA預(yù)測程序microRNA.org（http：//www.microrna.org/microrna/home.do），Target Scan（http：//www.targetscan.org/vert_60/） 和 PicTar（http ：//www.pictar.org/cgi-bin/Pic Tar_vertebrate.cgi）發(fā)現(xiàn)Slit2 的3'-UTR含有miR-200c的結(jié)合位點（見圖4A）。Western blot檢測結(jié)果顯示，Ox-LDL+In-miR-200c組Slit2

圖2 下調(diào)miR-200c對Ox-LDL損傷HAEC活性的影響

附表 各組吸光度值比較（±s）

附表 各組吸光度值比較（±s）

組別 0 h 12 h 24 h 48 h 72 h CON 組 0.28±0.05 0.46±0.10 0.93±0.08 1.42±0.11 1.64±0.12 Ox-LDL 組 0.29±0.03 0.38±0.08 0.62±0.05 0.85±0.06 0.96±0.08 Ox-LDL+In-miR-200c 組 0.26±0.03 0.40±0.06 0.76±0.08 1.15±0.13 1.36±0.07

圖3 miR-200c對Ox-LDL誘導(dǎo)的HAEC凋亡的影響

圖4 熒光素酶基因報告

表達(dá)水平與Ox-LDL組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-21.592，P=0.000），Ox-LDL+In-miR-200c組升高（見圖4B）。進(jìn)一步通過熒光素酶基因報告實驗發(fā)現(xiàn)，Ox-LDL+In-miR-200c轉(zhuǎn)染使攜帶野生型報告基因的Slit2 3'-UTR（WT）組熒光素酶活性高于Ox-LDL組（t=-11.253，P=0.000）（見圖 4C）。

2.5 干擾Slit2對細(xì)胞凋亡的影響

利用干擾小RNA（siRNA）干擾Slit2的表達(dá)，對轉(zhuǎn)染效率的檢測發(fā)現(xiàn)Slit2 siRNA可抑制Slit2表達(dá)水平（見圖5A）。與In-miR-200c組比較，Slit2 siRNA組吸光度值升高（t=8.601，P=0.001，見圖5B）。此外，Slit2 siRNA組細(xì)胞凋亡水平高于In-miR-200c組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-4.527，P=0.011，見圖5C）。

圖5 Slit2沉默對Ox-LDL誘導(dǎo)HAEC凋亡的影響

3 討論

Ox-LDL在動脈粥樣硬化及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[4-5]。Ox-LDL促進(jìn)平滑肌細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的生長和遷移，引起內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激和細(xì)胞損傷，并進(jìn)一步促進(jìn)形成動脈粥樣硬化斑塊[6-7]。Ox-LDL通過結(jié)合并激活凝集素樣ox-LDL受體1（LOX-1）誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，Ox-LDL誘導(dǎo)miR-200c在HAEC中高表達(dá)，預(yù)示miR-200c可能在Ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中具有一定的調(diào)控作用。ZHANG等[9]對糖尿病小鼠和患者的研究發(fā)現(xiàn)，miR-200c在糖尿病小鼠和患者動脈中的表達(dá)水平上調(diào)，并指出miR-200c可能是糖尿病血管病治療的重要靶點。MAGENTA等[3]的研究指出氧化應(yīng)激損傷上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）miR-200c的表達(dá)水平，并通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-200c可促進(jìn)HUVEC的增殖且抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本研究也發(fā)現(xiàn)，抑制miR-200c的表達(dá)可促進(jìn)HAEC細(xì)胞增殖并減弱Ox-LDL對HAEC凋亡的誘導(dǎo)作用。凋亡是清除有害刺激如Ox-LDL損傷細(xì)胞的過程，一定程度上代表著Ox-LDL對細(xì)胞的損傷程度[10]。動脈粥樣硬化發(fā)生過程中凋亡細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞凋亡可通過調(diào)控病變細(xì)胞進(jìn)而產(chǎn)生血管阻塞[11-12]。結(jié)合本研究結(jié)果，miR-200c對于Ox-LDL誘導(dǎo)的心血管損傷具有重要的調(diào)控作用。

為進(jìn)一步探討miR-200c調(diào)控Ox-LDL損傷HAEC的可能機(jī)制，本研究通過miRNA靶基因預(yù)測網(wǎng)站對比發(fā)現(xiàn)Slit2為miR-200c的潛在靶點，并通過熒光實驗證實該猜想。Slit2是Slit家族成員之一，參與血管形成等大部分器官系統(tǒng)的發(fā)育[13]。Slit2在癌癥、子癇驚厥以及增生性視網(wǎng)膜病變等人類疾病中的血管再生過程中均具有十分重要的作用。它與Robo1的結(jié)合可誘導(dǎo)腫瘤血管生成與淋巴管生成，并參與血管的發(fā)育[14]。LI等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，Slit2可促進(jìn)HUVEC的增殖、遷移和小管形成。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制Slit2表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)miR-200c沉默對Ox-LDL損傷HAEC的保護(hù)作用，表明miR-200c可能部分通過靶向作用于Slit2調(diào)控Ox-LDL損傷HAEC的增殖和凋亡，進(jìn)而起到保護(hù)HAEC免受Ox-LDL損傷的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明miR-200c在Ox-LDL損傷HAEC表達(dá)上調(diào)；抑制miR-200c表達(dá)可促進(jìn)HAEC細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡，由此可見miR-200c在Ox-LDL損傷HAEC中起著負(fù)調(diào)控的作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-200c對HAEC的調(diào)控作用是部分通過靶向作用于Slit2實現(xiàn)。這將為動脈粥樣硬化等類似心血管疾病的分子治療靶標(biāo)提供新的實驗依據(jù)，但其相關(guān)分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步的探索。