孫基豐，孫婷婷，李超，金秀妍，張昊

（長春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130022）

醛糖還原酶AKR1B1蛋白（Aldehyde Reductase，AR）是醛酮還原酶（AKRs）超家族中的重要成員之一。它是NADPH依賴型的多功能酶類，蛋白的空間結(jié)構(gòu)為一條含有巰基的單鏈的多肽，一般以單體的形式存在于生物體內(nèi)[1-3]。醛糖還原酶（AKRs）超家族的許多成員都與人類的各種腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，醛糖還原酶超家族中的許多成員已經(jīng)被作為腫瘤的診斷標(biāo)志物被用于癌癥的檢測。還有一些成員是癌癥潛在的診斷標(biāo)志物，是目前科學(xué)界研究的熱點(diǎn)[4]。

最近Ravinder等[5]發(fā)現(xiàn)：將醛糖還原酶小干擾RNA轉(zhuǎn)入人大腸癌細(xì)胞能夠抑制癌細(xì)胞的生長，表明醛糖還原酶可能在促進(jìn)癌細(xì)胞生長中起重要作用；而在腎上腺皮質(zhì)癌時(shí)醛糖還原酶表達(dá)下調(diào)，可以作為腎上腺癌的候選診斷標(biāo)志物[6]。還有研究表明抑制醛糖還原酶可以抑制腫瘤壞死因子α（TNFα）誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的增殖，激活核轉(zhuǎn)錄因子κB可能是其機(jī)制之一[7]，因?yàn)槿┨沁€原酶參與血管平滑肌細(xì)胞增殖，可能參與血管重塑[8]。醛糖還原酶除了促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖外，還可以促進(jìn)腎臟系膜細(xì)胞的增殖[9]，醛糖還原酶抑制劑能改善內(nèi)皮細(xì)胞功能[10]。越來越多的證據(jù)表明：多種存在氧化應(yīng)激的心血管疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、心肌缺血、血管再狹窄、心力衰竭和血管炎等都有醛糖還原酶的參與[11-15]。醛糖還原酶AKR1B1的活性還與糖尿病并發(fā)癥包括白內(nèi)障[16]、視網(wǎng)膜病變[17]、神經(jīng)病變[18]和腎病[19]存在因果關(guān)系。而糖尿病的多種慢性并發(fā)癥被認(rèn)為是糖尿病致死、致殘的主要原因。

本文主要對(duì)人源醛糖還原酶AKR1B1進(jìn)行密碼子優(yōu)化，使其在原核大腸桿菌中表達(dá)。制備醛糖還原酶AKR1B1多克隆抗體，建立ELISA方法，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和ELISA檢測技術(shù)，在分子和蛋白水平上對(duì)AKR1B1蛋白在肺細(xì)胞MRC-5和肺癌細(xì)胞A549表達(dá)進(jìn)行檢測與比較分析。為進(jìn)一步探索AKR1B1在人類肺癌中的發(fā)生發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 質(zhì)粒菌種及細(xì)胞

質(zhì)粒 AKR1B1-pET15b、菌種 E.coli DH5α和BL21（DE3）、MRC-5肺細(xì)胞、A549肺癌細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)BALB/c小鼠（18-22g，4周齡，雌性，5只）從長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購入。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

BCA蛋白定量試劑盒、細(xì)胞總蛋白提取試劑、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司；（去基因組）cDNA第一連合成試劑盒、總蛋白提取試劑盒（離心柱型）、SuperReal熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版（SYBR Green）均購自北京天根生化科技有限公司，其他藥品均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 重組蛋白的預(yù)表達(dá)及可溶蛋白制備

將重組質(zhì)粒pET-AKR1B1和pET 15b空載體分別誘導(dǎo)表達(dá)，37℃溫度，OD600為0.6時(shí)，IPTG誘導(dǎo)5h，總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳鑒定。蛋白表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，在最佳條件下大量培養(yǎng)重組菌，并進(jìn)行目的蛋白組氨酸柱純化，收集可溶性人醛糖還原酶AKR1B1蛋白，利用考馬斯亮藍(lán)G250法測定目的蛋白含量。

2.2 AKR1B1蛋白多克隆抗體的制備及ELISA檢測

在第一次免疫小鼠之前，對(duì)小鼠斷尾取血，低溫離心收集血清，作為陰性血清備用。利用制備的人醛糖還原酶AKR1B1蛋白腹腔注射免疫4只BALB/c小鼠，每周免疫1次，共免疫3次。最后一次免疫一周后，摘除小鼠眼球取血，室溫放置2-3h，低溫離心分離血清，間接ELISA方法測定抗體效價(jià)，-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 肺細(xì)胞及肺癌細(xì)胞培養(yǎng)及BCA法檢測

將培養(yǎng)制備好的實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞，使用PBS沖洗細(xì)胞，放入5-7倍的萃取試劑，并進(jìn)行多次的吹吸混勻。10000-14000rpm離心10min取上清。配制BCA工作液。抽取試劑標(biāo)準(zhǔn)稀釋液和未知的樣液150μL至孔板上。在各個(gè)孔中滴入150μL的BCA，充分混合，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。使用酶標(biāo)儀測量562nm下的OD數(shù)值，取平均數(shù)計(jì)算濃度。

2.4 AKR1B1在細(xì)胞中mRNA水平的鑒定

選取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使用天根公司的總mRNA提取試劑盒提取總mRMA，電泳鑒定。借助FastQuant系列的cDNA第一鏈合成試劑盒，進(jìn)行總RNA反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 重組蛋白的預(yù)表達(dá)及條件優(yōu)化結(jié)果

3.1.1 表達(dá)載體的鑒定

對(duì)重組表達(dá)菌株AKR1B1-pET-15b-BL21（DE3）構(gòu)建成功后，提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行一步電泳鑒定，結(jié)果表明重組質(zhì)粒條帶明顯高于對(duì)照質(zhì)粒大小如圖1所示（2-10泳道）；進(jìn)一步雙酶切鑒定，結(jié)果表明重組質(zhì)粒含有目的基因，大小在1000bp左右，如圖2所示（2泳道）。

圖1 AKR1B1-pET-15b一步鑒定圖1：pET-15b質(zhì)粒；2-10：AKR1B1-pET-15b；11：DNA Marker DL15000

圖2 酶切鑒定圖

3.1.2 重組蛋白預(yù)表達(dá)

對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)后的總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測分析，如圖3所示，通過重組菌株AKR1B1-pET-15b-BL21（DE3）表達(dá)結(jié)果與空菌pET-15b-BL21（DE3）表達(dá)結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在大約35.4KDa位置處，重組菌株總蛋白條帶中有一條清晰的蛋白條帶，成功表達(dá)了目的蛋白人醛糖還原酶AKR1B1（2-3泳道）。

圖3 人醛糖還原酶AK蛋白預(yù)表達(dá)圖

3.1.3 人醛糖還原酶AKR1B1蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化結(jié)果

經(jīng)過優(yōu)化的重組蛋白表達(dá)條件為：IPTG誘導(dǎo)劑濃度為：1.0mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)溫度為：16℃，誘導(dǎo)時(shí)間為：24小時(shí)，培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)速為：110rpm。在最優(yōu)條件下，上清中可溶蛋白表達(dá)最好，通過Ni-NTA親和層析柱純化，蛋白電泳結(jié)果顯示目的蛋白在大約35.4KDa處。

圖4 1：低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)marker 2，3：人醛糖還原酶AK蛋白

3.1.4 AKR1B1重組蛋白濃度的測定

利用考馬斯亮蘭G-250法測定目的蛋白濃度，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=8.9929X+0.0269，R2=0.9914，測得目的蛋白的OD595nm值為0.367，蛋白含量為1.9mg/ml，如圖5所示。

圖5 考馬斯亮藍(lán)50法測蛋白含量建立標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3.2 AKR1B1蛋白鼠多克隆體效價(jià)及最佳稀釋倍數(shù)

血清效價(jià)測定結(jié)果如下表1所示：抗體最高效價(jià)為32000。

表1 血清效價(jià)測定數(shù)據(jù)

3.3 BCA法定量檢測細(xì)胞中總蛋白含量

BCA法標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0003X+0.0924，R2=0.9962如圖6所示，由BCA試劑盒測得提取的蛋白在稀釋10倍的情況下，人肺細(xì)胞MRC-5 OD值為0.124，人肺癌細(xì)胞A549為OD值0.132。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到人肺細(xì)胞MRC-5的蛋白含量為1053μg/ml，人肺癌細(xì)胞A549蛋白含量為1320μg/ml。兩種細(xì)胞表達(dá)量看，人肺癌細(xì)胞A549的目的蛋白表達(dá)量遠(yuǎn)大于人肺細(xì)胞MRC-5的蛋白表達(dá)。

圖6 BCA法定量檢測細(xì)胞總蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.4 兩種細(xì)胞中目的蛋白含量測定

用原核表達(dá)的人醛糖還原酶AKR1B1蛋白為抗原建立了ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，該標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.1811ln(x)-0.2817，R2=0.9715，如圖7所示：

圖7 標(biāo)準(zhǔn)曲線

（2）兩種細(xì)胞中人醛糖還原酶AKR1B1含量對(duì)比如圖8所示，人肺細(xì)胞MRC-5和人肺癌細(xì)胞A549中目的蛋白含量分別為：0.82μg/mg，2.41μg/mg，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示人肺癌細(xì)胞A549中目的蛋白的含量約為人肺細(xì)胞MRC-5中的3倍。

圖8 兩種細(xì)胞中目的蛋白含量對(duì)比

3.5 cDNA鑒定結(jié)果

分別以MRC-5細(xì)胞和A549細(xì)胞的cDNA為模板，利用普通PCR反應(yīng)對(duì)設(shè)計(jì)的AKR1B1引物的特異性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖所示，PCR條帶單一且均在實(shí)驗(yàn)預(yù)期的大小范圍之內(nèi)，說明AKR1B1的引物特異性達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，可用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。

圖9 AK引物特異性驗(yàn)證：1；DNA Marker D000 2-3；49細(xì)胞cDNA PCR結(jié)果4-5：MRC-5細(xì)胞cDNA PCR結(jié)果

3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測結(jié)果如圖11和圖12所示，圖10是目標(biāo)基因的擴(kuò)增曲線，圖11是溶解曲線。顯示：在PCR過程中未發(fā)生非特異性擴(kuò)增，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果可信。

圖10 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖

圖11 實(shí)時(shí)熒光定量PCR溶解曲線圖

運(yùn)用2-△△CT的數(shù)據(jù)分析方法對(duì)獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果如表2所示。以MRC-5細(xì)胞中AKR1B1的表達(dá)量為參照因子，A549細(xì)胞中目的蛋白含量為MRC-5細(xì)胞中的4.1倍。

表2 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理結(jié)果

4 討論

本文成功構(gòu)建了AKR1B1-pET-15b-BL21（DE3）重組表達(dá)菌株，表達(dá)條件（IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度）進(jìn)行了優(yōu)化，當(dāng)IPTG濃度為1mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為24h，誘導(dǎo)溫度為16℃，可溶性蛋白表達(dá)最好。

利用原核表達(dá)得到的人醛糖還原酶AKR1B1蛋白免疫小鼠，獲得了多克隆抗體，抗體效價(jià)為1∶32000。

本文成功在體外培養(yǎng)了人肺細(xì)胞MRC-5，人肺癌細(xì)胞A549。通過間接ELISA實(shí)驗(yàn)在蛋白水平上對(duì)人醛糖還原酶AKR1B1蛋白在兩種細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行了檢測分析。結(jié)果顯示：人肺細(xì)胞MRC-5和人肺癌細(xì)胞A549中AKR1B1蛋白的濃度 分 別 為 0.81μg/mg，2.41μg/mg。 人肺 癌細(xì) 胞A549中AKR1B1蛋白的含量約為人肺細(xì)胞MRC-5中的3倍。

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)，結(jié)果顯示，在mRNA水平上人肺癌細(xì)胞A549中AKR1B1的含量為人肺細(xì)胞MRC-5中的4.1倍。

本文通過間接ELISA實(shí)驗(yàn)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析看，人醛糖還原酶AKR1B1蛋白在肺癌中確實(shí)存在過度表達(dá)，這提示我們，人醛糖還原酶AKR1B1蛋白在人類肺癌的病理過程中發(fā)揮作用。但是該酶發(fā)揮作用的機(jī)制還不清楚，是該酶代謝失調(diào)導(dǎo)致癌細(xì)胞的發(fā)生，還是由于癌細(xì)胞的產(chǎn)生導(dǎo)致該酶大過量表達(dá)，還有待于進(jìn)一步研究。本文研究結(jié)果AKR1B1在肺癌中的作用機(jī)制提供理論及實(shí)驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ)。