劉傳志，汪路涵，王越，趙天闊，侯玥

（長春理工大學 生命科學技術學院，長春 130022）

百草枯化學名稱是1-1-二甲基-4-4-聯(lián)吡啶陽離子鹽，是一種快速滅生性除草劑，對人毒性極大，一般LD50為20mg/kg，且無特效解藥。市面上多為百草枯20%紫藍色溶液，此類產(chǎn)品成人致死量為5-15ml/kg[1]。目前，國內外對于百草枯的致病機理尚不明確，而且沒有有效降低毒性的治療手段[2-4]。雖然我國已對百草枯的生產(chǎn)做出控制和銷售資質的管理，但每年仍有因百草枯或其類似物而中毒的患者，出現(xiàn)嚴重的病發(fā)癥甚至危及生命。因此，研究百草枯導致臟器損傷的機制就顯得十分重要?，F(xiàn)有證據(jù)表明百草枯對身體各個臟器都有毒性，其毒性是通過產(chǎn)生自由基而導致破壞作用的[5-7]。

前人有報道稱百草枯毒性的主要靶器官是肺，是依賴多胺攝取系統(tǒng)積聚濃度，發(fā)生氧化還原循環(huán)途徑產(chǎn)生大量促氧化劑反應性物質[8，9]。由于在肺泡中I、II型細胞和細支氣管細胞膜上多胺轉運系統(tǒng)的大量表達，肺組織的百草枯濃度要比血漿高出6-10倍。造成肺纖維化，使肌成纖維細胞（MFb）活化增生[10，11]，進一步導致肺表面活性劑系統(tǒng)的功能異常所致。同時巨噬細胞釋放炎性因子如：TNF-α、IL、IFN-γ、磷脂酶（PLA2）等。使巨噬細胞發(fā)生組織內聚、親潤、活化，自由基釋放增加，正反饋性加劇組織損傷。Takeyama等人[12]用人肺上皮樣細胞系L123進行體外實驗，發(fā)現(xiàn)百草枯可導致DNA細胞結構破壞，組織細胞從G1期進入S期。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，線粒體內膜脂質過氧化反應，造成線粒體功能障礙，并能誘導體外肺細胞A549肌動蛋白骨架破壞，膜通透性改變，線粒體內膜異常去極化，解偶聯(lián)和基質腫脹造成細胞凋亡。同時百草枯對細胞通路還有很大的影響，絲裂素活化蛋白激酶（MAPKs）通路、核因子κB（NF-κB）通路、氧化應激反應等。臨床上誤服百草枯可導致口腔、舌咽及胃、食道粘膜糜爛潰瘍，有時還伴有發(fā)熱嘔吐、呼吸困難等表現(xiàn)。本文旨在探究不同劑量百草枯對大鼠血液各項指標的影響以及對大鼠各臟器器官的病變狀況，借此分析百草枯對大鼠的生理性毒性和免疫功能的損傷，為進一步揭示百草枯或其類似物的致毒機理提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物制備

SD大鼠購于吉林大學實驗動物中心，編號2017000185550。6-7周雌性，共20只，分為4組，每組5只，第5組為對照組。標準顆粒飼料，給水充足，飼養(yǎng)在長春理工大學生命科學技術學院動物房。

百草枯溶液：1.0mg/mL、0.5mg/mL、0.1mg/mL的各100ml。每日晚18時向實驗組大鼠分別灌胃劑量為：0.1mg、0.5mg、1.0mg的百草枯，連續(xù)灌胃7天，同時向對照組灌胃等計量的生理鹽水。

1.2 儀器及耗材

百草枯（江蘇省南京市紅太陽生物化學有限責任公司）、Leica石蠟切片機（德國 1850 UV）、FV1000型Olympus激光共聚焦顯微鏡、5810R型低溫高速離心機、HH-501A型超級恒溫水浴、LR40型制冰機、CX31-12C02型Olympus顯微鏡、多聚甲醛、無水乙醇、明膠、蘇木素、二甲苯、Tunel染色試劑盒（碧云天 C1086）、血常規(guī)使用全自動血液分析儀和EDTA抗凝采血管（長春理工大學校醫(yī)院）。

2 實驗方法

2.1 大鼠懸尾實驗

將大鼠移入實驗室適應30min，在大鼠尾端膠帶固定，使大鼠頭向下懸掛，并注意避免機械性損傷，懸掛臺使大鼠離桌面30cm的懸掛點，由觀察者分別記錄各組大鼠的放棄掙扎時間，并記錄數(shù)據(jù)平均值用于統(tǒng)計。用于統(tǒng)計百草枯對大鼠情緒抑郁性狀態(tài)、比較大鼠體能變化，揭示藥物對大鼠的行為活動造成的影響。數(shù)據(jù)采用mean±SD表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.2 大鼠血常規(guī)

大鼠采用心臟穿刺采血，儲存于EDTA抗凝采血管內，將收集到的各組大鼠血液標記，充分混勻后，送至校醫(yī)院分析化驗。各項數(shù)據(jù)以mean±SD表示，各組間的差異顯著性采用SPSS 13.0 for Windows統(tǒng)計軟件進行分析SD大鼠常見血液學檢測指標參考范圍參照文獻[12].

2.3 大鼠臟器檢測

取實驗組SD大鼠肺、腎、肝、脾處器官檢測細胞凋亡情況，將取出的組織，剪切成2×2×2mm3的小塊，經(jīng)放置于多聚甲醛浸泡48h，樣本浸泡流水沖洗30分鐘去除組織中的固定液。然后浸泡在50%、75%、無水乙醇脫水。包埋樣品托上涂一層OCT包埋膠，4℃冰箱預冷5min，讓OCT膠浸透組織。樣品速凍架速凍，組織置于樣品托上，其上再添一層OCT膠，冷凍30min。恒溫冰凍切片機切片，切薄片至6-8μm。切片時，低溫室內溫度以-15℃～-20℃為宜，溫度過低組織易破碎，抗卷板的位置及角度要適當，載玻片附貼組織切片。切好室溫放置30min后，晾干。PBS溶液洗5min×3。封閉BSA蛋白、進行Tunel染色，顯微鏡觀察，分析取樣組織器官的細胞凋亡情況，借以評估百草枯中毒致大鼠肺、腎、肝、脾器官損傷情況。

3 結果與討論

3.1 大鼠懸尾實驗結果

將連續(xù)7天灌胃有百草枯的大鼠進行懸尾實驗觀察，計時6min后停止，對大鼠后4min的不動時間進行統(tǒng)計。不動時間最短的是1組，即對照組，為（35.0±3.2）s，不動時間最長的是第三組為（165.0±19.2）s。統(tǒng)計結果表明：百草枯使得大鼠明顯虛弱，且濃度越大的藥液造成的損傷更為嚴重，引發(fā)大鼠體力下降，情緒低落，興奮性降低。且在對SD大鼠觀察中發(fā)現(xiàn)高濃度給藥組大鼠呼吸劇烈，胸腔起伏明顯。這提示百草枯可能對大鼠肺部造成損傷。

表1 大鼠懸尾實驗結果

3.2 大鼠血常規(guī)檢測結果

將連續(xù)7天灌胃有百草枯的大鼠，心臟穿刺采血，送至校醫(yī)院進行血常規(guī)檢驗。隨著灌胃百草枯溶液的濃度和劑量的加大，其中白細胞、單核細胞數(shù)的下降、淋巴細胞增加表明機體免疫功能遭到損害，伴有嚴重的炎癥反應，大鼠腹腔內積液較多，胸腔水腫并有渾濁腔液，尤其以1.0mg/D組最為明顯。

表2 SD大鼠血常規(guī)檢測主要部分指標（第三組）

3.3 大鼠臟器檢測結果

將連續(xù)7天灌胃有百草枯的大鼠，取大鼠肺、肝、腎、脾等組織，冰凍切片處理，進行Tunel染色，檢測細胞凋亡情況。實驗采用碘化丙啶（propidine iodide，PI）核酸染料，不能透過完整的細胞膜，在凋亡中晚期的細胞和死細胞，能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。生凋細胞，基因組DNA開始斷裂，暴露的3'末端羥基，可以在脫氧核苷酸轉移酶催化下加上綠色熒光探針熒光素（FITC）標記的dUTP。

圖1 第三組肺凋亡染色結果

圖2 第一組肺凋亡染色結果

圖3 第三組肝凋亡染色結果

圖4 第一組肝凋亡染色結果

圖5 第三組脾調亡染色結果

圖6 第一組脾凋亡染色結果

圖7 第三組腎凋亡染色結果

圖8 第一組腎凋亡染色結果

從上述凋亡染色實驗結果顯示：第三組，大鼠肺臟出現(xiàn)大量的死亡細胞，而凋亡的細胞相對較少，但卻有大量的細胞處于凋亡狀態(tài)。在肝臟、脾、腎等臟器的IHC檢測中，在高劑量百草枯實驗組中都發(fā)現(xiàn)有較多的細胞發(fā)生死亡，且肝細胞凋亡損傷較重。第一組低劑量百草枯大鼠肺細胞僅有部分死亡，且損傷相對較輕，但在肝、脾、腎等臟器細胞損傷大致相當，表明低劑量的百草枯對大鼠臟器有一定的傷害作用?？傊B續(xù)七天灌胃1.0mg劑量的百草枯對大鼠肺部造成嚴重損害，其它臟器也損傷較重。連續(xù)七天灌胃0.1mg劑量的百草枯對肺部就能誘發(fā)肺細胞的凋亡，對肝、脾、腎等亦有不同程度傷害。

4 結論

本文采用連續(xù)七天不同濃度的百草枯溶液灌胃大鼠，構建百草枯中毒大鼠模型。通過大鼠懸尾實驗、血常規(guī)檢驗、IHC組織切片實驗，分析百草枯對大鼠制毒機制。實驗表明連續(xù)七天灌胃1.0mg劑量百草枯大鼠體能下降嚴重，情緒抑郁，飲食量和活動性減少，對外界刺激敏感度下降。血常規(guī)分析血紅細胞含量增多，血紅蛋白增加，免疫相關細胞增多，提示大鼠免疫應答劇烈，出現(xiàn)炎癥反應。IHC組織切片凋亡染色發(fā)現(xiàn)高劑量百草枯對大鼠肺部造成極其嚴重的損害，肺細胞大量死亡，幾乎全部肺內組織發(fā)生細胞死亡，這與懸尾實驗中第三組大鼠體力下降，呼吸急促相符，這一結果與前人研究相一致。同時高劑量百草枯對肝、脾、腎臟也產(chǎn)生了影響，出現(xiàn)不同程度的細胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。提示百草枯對大鼠肺細胞有明顯的致死性，對肝、腎、脾等組織也有不同程度的損害。在0.1mg的劑量下可對大鼠造成不可逆性的傷害。綜上所述，通過對大鼠灌胃百草枯農藥，對其生理特征的研究提示，一旦誤服百草枯農藥，必須立即洗胃灌腸導泄持續(xù)胃腸減壓，吸出胃液殘留毒物，藥物對肺部損傷將會產(chǎn)生嚴重的后果，中毒嚴重者只能換血或者肺纖維化后切除。針對百草枯對肺細胞的損傷，探究其損傷機制和代謝類型，開發(fā)相關抑制劑性藥物或解毒制劑，將是未來主要研究方向。