鄒蓉 唐健民 史艷財(cái) 蔣運(yùn)生 韋霄 付嶸

摘 要：對(duì)東興金花茶（Camellia tunghinensis）的花部特征和開花進(jìn)程進(jìn)行了研究，并分別在野生居群、基因庫(kù)居群進(jìn)行了套袋試驗(yàn)和傳粉者觀察。結(jié)果表明：東興金花茶具兩性花，花部結(jié)構(gòu)具有典型的蟲媒花特征，花朵大，金黃色，花瓣基部可分泌蜜汁，花粉數(shù)量多，有利于吸引昆蟲來(lái)傳粉。單花花期一般3～5天，開花進(jìn)程可分為初開期、盛開期、末花期和凋落期。整個(gè)單花花期內(nèi)，花粉和柱頭都具有生活力，花朵剛剛開放時(shí)，部分花藥已散粉，且花粉具有活力，此時(shí)柱頭具有弱可授性，東興金花茶的繁育系統(tǒng)為異交，部分自交親和，需要傳粉者。野生居群的主要傳粉昆蟲為蜜蜂，訪花頻率為7.83次/d，基因庫(kù)居群的主要傳粉昆蟲也為蜜蜂，訪花頻率分別為8.65次/d，傳粉昆蟲的種類少，但訪花頻率不高，各居群的東興金花茶花粉傳播受到一定資源限制。在野生、基因庫(kù)兩種生境下，東興金花茶自然條件下座果率分別為8.3%、10%，果期敗育率分別為58.6%、51.3%，資源限制可能是其低結(jié)實(shí)率的主要原因。

關(guān)鍵詞：繁育系統(tǒng)；傳粉；資源限制；東興金花茶

一、材料和方法

1.研究地點(diǎn)。研究地點(diǎn)分別位于廣西防城金花茶國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)核心區(qū)的野生居群、廣西防城金花茶國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)上岳保護(hù)站金花茶基因庫(kù)居群。

2.研究方法

（1）花部形態(tài)和開花動(dòng)態(tài)觀測(cè)。在野生居群，隨機(jī)摘取盛花期的花20朵，測(cè)量花柄長(zhǎng)和寬、萼片數(shù)量和大小、花口徑、花瓣長(zhǎng)和寬、花絲數(shù)量、花絲長(zhǎng)、花藥長(zhǎng)、花柱數(shù)量、花柱長(zhǎng)、子房直徑和胚珠數(shù)量。標(biāo)記20朵即將開放的花，觀察和記錄花朵的開放過程，直至花瓣脫落。

（2）花粉活力測(cè)定。新鮮花粉生活力測(cè)定：1.選某個(gè)晴天上午，采集新鮮花粉（當(dāng)日開放的花朵），置去離子水中，于25℃下光照培養(yǎng)2、4、8、12、16、24h后在光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)花粉萌發(fā)率，確定花粉萌發(fā)所需要的培養(yǎng)時(shí)間；2.采集開花不同天數(shù)花朵的花粉，于于25℃下光照培養(yǎng)24h，光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)，比較其萌發(fā)率；3.將新鮮花粉，分別于20℃、25℃和30℃下光照培養(yǎng)24h，光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)，比較東興金花茶新鮮花粉在3個(gè)不同溫度下的萌發(fā)率。

（3）雜交指數(shù)（Outcrossing index，OCI）的估算。按照Dafni的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行花朵大小及開花行為的測(cè)定，由OCI值評(píng)判繁育系統(tǒng)類型（Cruden，1977）。

（4）花粉-胚珠比（Pollen-ovule ratio， P/O）的估算。隨機(jī)選即將開放但花藥尚未開裂的花10朵，每朵花取5個(gè)花藥擠碎于70%乙醇溶液，定容至4ml，搖勻后用微量注射器取2ul懸浮液在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)花粉數(shù)量，重復(fù)5次，并統(tǒng)計(jì)每朵花的花藥數(shù)，計(jì)算單花花粉總量。接著用刀片橫切子房，在解剖鏡下記錄胚珠數(shù)目。每朵花的P/O比用該花的花粉總量除以胚珠數(shù)目得到。依據(jù)Cruden的標(biāo)準(zhǔn)評(píng)判繁育系統(tǒng)類型。

（5）套袋試驗(yàn)。依Dafni描述的方法進(jìn)行下述處理：①對(duì)照：不套袋，不去雄，自由傳粉，用于檢測(cè)自然條件下的座果率；②開花前套袋，不去雄，檢測(cè)是否存在自花授粉；③同株異花授粉：去雄，套袋，同株異花之間人工授粉，檢測(cè)自交親和性；④異株異花授粉：去雄、套袋，用不同植株的花粉進(jìn)行異花授粉，檢測(cè)座果率；⑤自然條件下的異花傳粉，不套袋、去雄、自由傳粉，檢測(cè)座果率。⑥套袋、去雄，檢測(cè)是否具有無(wú)融合生殖。依據(jù)各居群花朵數(shù)量的多少，每處理取50～100朵花進(jìn)行試驗(yàn)。取即將開放的花，于花藥未散開前去雄，授粉試驗(yàn)于去雄后1d和2d各進(jìn)行1次，所授花粉至少來(lái)自3朵花。3個(gè)月后統(tǒng)計(jì)座果情況，座果率=幼果數(shù)/花數(shù)×100%。

（6）傳粉者觀察。在盛花期的晴朗天氣，觀察傳粉昆蟲種類、訪花行為及訪花頻率。具體方法是：從8：00～18：00，以每30min為一個(gè)統(tǒng)計(jì)單位，隨機(jī)標(biāo)記5～10朵花，觀察和記錄整個(gè)單花期不同種類昆蟲的訪花時(shí)間、停留時(shí)間、訪花次數(shù)及訪花行為，并計(jì)算昆蟲的訪花頻率。采集訪花者制成標(biāo)本，鑒定到科、屬或種。

套袋試驗(yàn)和傳粉者觀察分別在2個(gè)居群進(jìn)行，其余試驗(yàn)在野生居群進(jìn)行。野生居群和栽培居群的試驗(yàn)在3月上旬進(jìn)行。

3.數(shù)據(jù)分析。本文所有數(shù)據(jù)處理和作圖均由Excel2003軟件完成。

二、結(jié)果與分析

1.花部特征和開花動(dòng)態(tài)。東興金花茶花兩性，花金黃色，花柄長(zhǎng)9～13mm；苞片5～6片，細(xì)小，分散于花柄上，萼片5，近圓形，長(zhǎng)3～5mm，寬2～5mm，背有毛；花瓣5～7片，基部連合2～4mm，倒卵形，長(zhǎng)1～2cm，寬2～3cm，無(wú)毛；雄蕊130～200枚，花藥長(zhǎng)0.18～0.33mm，分4-5列，花絲長(zhǎng)1.6～2.5cm，外輪花絲基部連生2-5mm，無(wú)毛；花柱3～4條，離生，長(zhǎng)1.8-3.0cm，柱頭位置與花藥齊平或高出花藥3～7mm；子房近球形，3～4室，直徑2.0～2.6mm，胚珠6～12枚。

東興金花茶單花花期一般為3～5d，開花進(jìn)程可分為4個(gè)階段：初開期——花蕾膨大，花瓣逐漸松動(dòng)，頂端裂開，出現(xiàn)“小口”并可見雄蕊，花型呈鐘狀；盛開期——花朵繼續(xù)開放，花瓣向外伸展，花藥裂開散發(fā)花粉，花型呈傘狀；末花期——花瓣向外平展，尖端反卷，有萎蔫跡象，花藥散粉完畢，呈干癟狀，柱頭淡黃色，有少量花粉附著；凋落期——花朵開始凋落，花瓣連同花絲一同脫落，萼片宿存并包裹子房，柱頭外露。

東興金花茶花朵開放時(shí)，一般開口朝下，花瓣基部分泌蜜汁?；ǘ淙炀砷_放，花柱和花絲在花期伸長(zhǎng)不明顯，柱頭位置與花藥齊平或高出花藥3～7mm。部分花藥于開花前或花朵開放時(shí)開裂散粉，開花后6h全部花藥散粉，12h后達(dá)到散粉盛期，2～3d 后進(jìn)入散粉末期。柱頭淡黃色，能分泌少量粘液，花瓣脫落后逐漸萎蔫變褐?；ǘ溟_放期間無(wú)明顯氣味。

野生居群始花期為2月末，盛花期為3月上旬至3月中旬，末花期為4月上旬。基因庫(kù)居群始花期為2月中下旬，盛花期為3上旬至中旬，末花期為3月末?；驇?kù)居群的開花物候比野生居群早7-10天左右。

2.花粉活力測(cè)定

（1）開花不同天數(shù)后的花粉活力。東興金花茶花瓣展開，花藥暴露于空氣中，數(shù)小時(shí)后即開始散粉，此時(shí)花粉即具有活力，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，花粉的活力逐漸下降，開花一天內(nèi)的花粉活力最高，為57.8%；至第4d，花粉活力與脫落花朵的活力相近，分別為0.40%和0.25%，基本上可認(rèn)為是無(wú)活力。開花后2h～4d，柱頭都具有可授性，1～3d可授性最強(qiáng)?？梢姈|興金花茶花藥散粉和柱頭可授期并不存在明顯的時(shí)間分離，為雌雄同熟。

Note： -/+ means some stigmas have receptivity， some havent； + means stigmas have receptivity； ++ means stigmas have higher receptivity； +++ stigmas have the highest receptivity.

3.雜交指數(shù)（OCI）和花粉-胚珠比（P/O）

東興金花茶花口徑為3.99±0.50cm，單花花徑>6mm，計(jì)為3；花藥開始散粉時(shí)部分柱頭具有可授性，雌蕊和雄蕊幾乎同時(shí)成熟，計(jì)為0；開花時(shí)柱頭和花藥齊平或高出柱頭3～5mm，計(jì)為0或1；因此東興金花茶的OCI為3或4。根據(jù)Dafni的標(biāo)準(zhǔn)，東興金花茶的繁育系統(tǒng)為兼性異交類型或異交，部分自交親和，需要傳粉者。

東興金花茶單花花粉量約為2517941.33，胚珠數(shù)為8.0±1，P/O為298723.07，根據(jù)Cruden標(biāo)準(zhǔn)，該物種的繁育系統(tǒng)屬于專性異交。

4.套袋試驗(yàn)

套袋試驗(yàn)結(jié)果表明，去雄套袋不能結(jié)果，可認(rèn)為東興金花茶不存在無(wú)融合生殖；不去雄、套袋、自花授粉，不論在野生居群還是基因庫(kù)居群都只有一個(gè)結(jié)果，座果率分別為3%及2.5%，表明東興金花茶能自動(dòng)自花授粉，但座果率極低。野生居群對(duì)照的座果率為8.3%，人工異株異花授粉座果率為15%，人工同株異花授粉座果率為7.9%，表明東興金花茶的繁育系統(tǒng)異交為主，部分自交親和，需要傳粉者。野生居群和基因庫(kù)居群的套袋試驗(yàn)結(jié)果亦證實(shí)了上述結(jié)論。野生居群自然條件下的座果率（8.3%）和異株異花授粉的座果率（15%）相比，表明在野生條件下東興金花茶的結(jié)實(shí)并不受到花粉限制。對(duì)東興金花茶各居群自然條件下的果實(shí)敗育情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，在野生居群和基因庫(kù)居群，果期敗育率分別為58.6%、51.3%。后期（7月中旬）追加兩個(gè)處理，對(duì)自然自花授粉的果進(jìn)行套袋與不套袋對(duì)比（處理數(shù)都為28個(gè)）；11月采收發(fā)現(xiàn)套袋的果實(shí)結(jié)實(shí)率達(dá)89.3%，而不套袋的果實(shí)結(jié)實(shí)率只有10.7%

5.傳粉者的種類、訪花行為和訪花頻率

在東興金花茶野生居群的主要傳粉昆蟲為蜜蜂，此外，還發(fā)現(xiàn)蝴蝶1種，小蜂鳥1種，但訪花次數(shù)少，不是有效傳粉者。基因庫(kù)居群的主要傳粉者為蜜蜂。

在2種不同的生境條件下，蜜蜂對(duì)東興金花茶的訪花頻率有一定差異。在野生居群蜜蜂的訪花頻率在10：00之前，由于溫度較低，濕度較大，很少見到訪花蜜蜂活動(dòng)，10：00之后，溫度開始升高，蜜蜂活動(dòng)逐漸增加，10：00～12：00是蜜蜂的訪花高峰期，平均訪花次數(shù)為13.45次/h，在13：30～15：00蜜蜂活動(dòng)又明顯增加，平均訪花次數(shù)為8.93次/h，15：00過后蜜蜂活動(dòng)明顯減少?；驇?kù)居群蜜蜂的訪花頻率在9：00～11：30即達(dá)到訪花高峰期，平均訪花次數(shù)達(dá)16.55次/h，高于野生居群高峰期的訪花頻率，在13：30～15：30蜜蜂活動(dòng)又明顯增加，平均訪花次數(shù)達(dá)8.45次/h，15：30以后，訪花次數(shù)就大幅降低。天氣狀況對(duì)蜜蜂訪花影響較大，雨天和低溫陰天，極少見到蜜蜂訪花。

三、討論

東興金花茶的主要傳粉生物是蜜蜂，在本次試驗(yàn)研究中，基因庫(kù)居群生長(zhǎng)環(huán)境下蜜蜂的訪花頻率更高，為8.65次/d，高于野生居群的7.83次/d?；驇?kù)居群的東興金花茶的座果率為10%，高于野生環(huán)境的8.3%，果期敗育率分別為基因庫(kù)居群58.6%、野生51.3%?？梢圆扇》N花、養(yǎng)蜂合理劃分區(qū)域，互利共贏的方式來(lái)提高蜜蜂訪花率。另外，天氣因素影響蜜蜂的活動(dòng)頻率，進(jìn)而影響了東興金花茶的結(jié)實(shí)率，種植人員可以根據(jù)天氣預(yù)報(bào)通過人工干預(yù)的方法影響其開花時(shí)間，進(jìn)而減小天氣影響。

東興金花茶具有蟲媒和鳥類傳粉的特征，花朵大，黃色，花瓣基部分泌大量蜜汁，花粉數(shù)量多，這有利于吸引昆蟲和鳥類來(lái)傳粉，同時(shí)東興金花茶花朵柱頭位置稍高于花藥，使得傳粉效率大大提高。東興金花茶的花粉活力和柱頭可授性在開花前3天都維持在較高水平，且蜂類訪花高峰期與花粉活力最高時(shí)期和柱頭最佳授粉期高度一致，這有利于其雄性階段花粉的輸出以及雌性階段柱頭接受花粉，可保障其有效傳粉及異交成功。東興金花茶花期在3～5d，種群花期可持續(xù)1～2個(gè)月，這種開花持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)且開花不同步，一方面保證植株在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)能成功完成異花傳粉受精過程而保證生殖成功，另一方面也可以降低花期惡劣的自然環(huán)境對(duì)其生殖成功造成的不良影響，應(yīng)為其長(zhǎng)期適應(yīng)環(huán)境影響所形成的一種生殖策略。

P/O、OCI及人工控制授粉試驗(yàn)等不同處理結(jié)實(shí)率的比較試驗(yàn)都是目前應(yīng)用較多的檢測(cè)繁育系統(tǒng)的手段。依據(jù)雜交指數(shù)估算結(jié)果，東興金花茶的OCI值為3或4，繁育系統(tǒng)為兼性異交類型或異交，部分自交親和，需要傳粉者。按照Curden花粉-胚珠比（P/O）的觀點(diǎn)，東興金花茶的P/O為298723.07，繁育系統(tǒng)為專性異交。套袋試驗(yàn)結(jié)果顯示，表明東興金花茶的繁育系統(tǒng)異交為主，部分自交親和，需要傳粉者，屬于專性異交植物。

對(duì)一物種有效傳粉昆蟲種類的確認(rèn)是了解其生殖生物學(xué)特點(diǎn)的重要內(nèi)容，也是理解該物種稀有和瀕危機(jī)制的前提。套袋試驗(yàn)結(jié)果表明，東興金花茶自然結(jié)實(shí)率8.3%大大低于人工異株異花授粉15%，表明東興金花茶存在花粉限制，這與野外傳粉者的觀察相一致。東興金花茶的有效傳粉者只有蜜蜂一種。傳粉者種類少，訪花頻率低，花粉限制是東興金花茶自然條件下低結(jié)實(shí)率的主要原因。

由于東興金花茶具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，野外調(diào)查表明，除保護(hù)區(qū)的核心區(qū)外，東興金花茶人為破壞和采挖極為嚴(yán)重，使得居群中花朵數(shù)量較少，再加上花期不同步，傳粉過程中有可能缺少異花花粉，結(jié)實(shí)率降低，并引起近交衰退，進(jìn)一步加劇了東興金花茶的瀕危狀況。

作者簡(jiǎn)介：鄒蓉（1982-）女，現(xiàn)任助理研究員，主要從事植物生理生態(tài)學(xué)研究。

通訊作者簡(jiǎn)介：韋霄（1967-）男，現(xiàn)任研究員，主要從事經(jīng)濟(jì)植物引種馴化及瀕危植物保護(hù)生物學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：本課題由廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015GXNSFBA139089）。