李 楠，柳越冬，王長洪，崔世超，張曉明

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，遼寧 沈陽 110032；2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床學(xué)院，遼寧 沈陽 110101；3. 沈陽軍區(qū)總醫(yī)院中醫(yī)科，遼寧 沈陽 110016)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種特發(fā)于結(jié)腸和直腸黏膜或黏膜下層的一種邊界清楚的炎性反應(yīng)性疾病，其與克羅恩病(crohn disease, CD)共屬炎性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)，其臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、里急后重、黏液膿血便等，發(fā)病機制尚未明了[1]。目前，臨床中治療UC主要以水楊酸制劑和糖皮質(zhì)激素為主，代表藥物有美沙拉嗪和柳氮磺吡啶等，但是毒副作用較大，無法長期用于治療[2]，中醫(yī)藥治療本病有著一定優(yōu)勢。在課題組前期研究證實，含有中藥青黛所組成的優(yōu)化潰結(jié)方對治療UC模型大鼠具有一定的療效[3]。靛玉紅為中藥青黛的主要有效成分，已被證實對腫瘤細胞及耐藥腫瘤細胞有殺傷作用[4]。本實驗擬觀察靛玉紅對UC模型大鼠的治療效果，通過其對UC模型大鼠疾病活動指數(shù)(disease activity index, DAI)評分、結(jié)腸組織病理學(xué)切片、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)水平，以及大鼠結(jié)腸組織中腸三葉因子(intestinal trefoil factor, ITF)mRNA表達的影響，驗證靛玉紅對UC模型大鼠的療效，并對其作用機制進行初步探討。

1 材料

1.1實驗動物清潔級SD大鼠48只，♂，體質(zhì)量(200±20)g，購自遼寧省實驗動物資源中心，合格證號：SCXK(遼)2015-0001。

1.2藥物與試劑靛玉紅，每瓶20 mg，純度≥98.0%，北京索萊寶科技有限公司，批號：NO.1221A022；柳氮磺吡啶腸溶片(sulfasalazine tablets, SASP)，每片0.25 g，上海福達制藥有限公司，批號：H31020840；大鼠TGF-β1 ELISA試劑盒，上海朗頓生物技術(shù)有限公司，批號：20170302JG；Easy Pure?RNA Kit(批號：#L10322)、Trans Script?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(批號：#L10303)，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR引物由英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。

1.3儀器冷凍離心機(美國科峻儀器公司)；DYY-6C電泳儀(北京六一儀器廠)；二氧化碳培養(yǎng)箱(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；UV-1750紫外分光光度計(日本島津公司)；TP600 PCR儀(日本TaKaRa公司)；凝膠成像系統(tǒng)(杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)；SUNRISE酶標儀(瑞士TECAN公司)。

2 方法

2.1實驗分組將48只清潔級SD大鼠，采用隨機數(shù)字表法，按體質(zhì)量隨機分為4組，分別為正常組、模型組、SASP組、靛玉紅組，每組12只。

2.2UC模型的制備大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，正常進食、進水，保持飼養(yǎng)環(huán)境適宜。禁食、不禁水24 h。除正常組大鼠外，其余大鼠均采用5%三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)的造模方法：異戊巴比妥麻醉大鼠后，將鈍頭導(dǎo)管從肛門插至距肛門8 cm處，按80 mg·kg-1TNBS(20 mg TNBS溶解于50%乙醇1 mL，4 mg·kg-1大鼠體質(zhì)量)緩慢灌腸。15 d后，再次給予30 mg·kg-1TNBS溶液(20 mg TNBS溶解于500 mL·L-1乙醇1 mL，1.5 mL·kg-1)灌腸，制備大鼠UC模型[5-6]。

2.3給藥藥物干預(yù)于造模后d 5開始,各組小鼠灌胃給藥7 d。參考《中藥藥理研究方法學(xué)》[7],根據(jù)人與大鼠的藥物劑量折算系數(shù)，算出各組小鼠的給藥劑量,灌胃時根據(jù)小鼠體質(zhì)量給藥(40 mL·kg-1)。正常組及模型組:按40 mL·kg-1給予0.5%羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethylcellulose, CMC)灌胃;靛玉紅組:給予靛玉紅,劑量為9.64 mg·kg-1,溶于5% CMC溶液中;SASP組：劑量為每日292.86 mg·kg-1,片劑碾碎溶于5% CMC溶液中[8]。給藥期間各組小鼠自由進食、飲水。

2.4標本采集與DAI評分自實驗d 1開始，每日同一時間稱取各組大鼠體質(zhì)量，記錄其大便性狀，及大便隱血/肉眼血便狀況。大便隱血檢測運用便隱血檢測試紙(聯(lián)苯胺法)：挑取少許糞便于濾紙上，加1%聯(lián)苯胺冰醋酸溶液1～2滴，加3% H2O21～2滴。加試劑后2 min試紙反應(yīng)區(qū)不顯色為隱血試驗陰性(-)；加試劑10 s后，反應(yīng)區(qū)顯淺藍色，漸變藍色為隱血試驗陽性(+)；加入試劑后反應(yīng)區(qū)初顯淺藍褐色，漸加深變明顯褐色為隱血試驗陽性()；加入試劑后反應(yīng)區(qū)立即顯藍褐色為隱血試驗陽性()。根據(jù)文獻方法，對各組大鼠進行DAI評分[9]。

自給藥起d 7，各組大鼠用異戊巴比妥麻醉，開腹，在肛門1 cm以上取4～6 cm病變腸管組織，縱行剪開后，用4℃ 0.9%氯化鈉溶液沖洗，留取部分結(jié)腸組織。以濾紙吸干水分后，用4%多聚甲醛固定，以供制作病理切片，觀察各組大鼠腸黏膜的組織形態(tài)學(xué)變化。

2.5ELISA法檢測結(jié)腸組織TGF-β1水平取各組結(jié)腸組織100 mg，勻漿后取上清液，按照TGF-β1試劑盒說明書進行操作檢測。

2.6RT-PCR法檢測ITFmRNA表達取50 mg結(jié)腸組織剪碎，按照RNA提取試劑盒操作提取組織總RNA。立即進行cDNA第一鏈合成，反應(yīng)條件為25℃ 10 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，42℃ 1 min退火。產(chǎn)物cDNA于4℃保存，以待合成DNA。合成DNA反應(yīng)體系為：2×PCR Super Mix 12.5 μL，RNase Free H2O 8.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL(各引物序列見Tab 2)，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 2 μL。反應(yīng)條件為：94℃ 30 s；58℃ 30 s，72℃退火30 s后，重復(fù)40個循環(huán)后，行電泳分析。以β-actin為內(nèi)參照，引物序列如下：β-actin上游引物5′-CCTGTGG-CATCCATGAAACTAC-3′，下游引物5′-CCAGGGC-AGTAATCTCCTTCTG-3′；ITF上游引物5′-TGGGTCCTCCTGCAAAGC-3′，下游引物5′-CATTTGGGATGCTGGAGTCA-3′。

2.7統(tǒng)計學(xué)方法統(tǒng)計學(xué)方法采用Graph Pad 7軟件，組間比較用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1靛玉紅對UC大鼠DAI評分的影響TNBS滲入大鼠腸腔后可引起結(jié)腸組織發(fā)生潰瘍、壞死，大鼠出現(xiàn)食欲減退、精神萎靡、毛發(fā)枯松無光澤、體質(zhì)量下降，并伴有腹瀉、血便等癥狀。如Fig 1所示，與模型組比較，靛玉紅組及SASP組DAI評分明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

Fig 1 Effect of indirubin on DAI score of UC

##P<0.01vsnormal;**P<0.01vsmodel

3.2靛玉紅對UC大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)HE染色的影響對大鼠結(jié)腸組織進行HE染色，如Fig 2所示，正常組大鼠結(jié)腸黏膜上皮完整，結(jié)構(gòu)清晰，腺體排列規(guī)則，固有層內(nèi)杯狀細胞豐富，未見炎癥細胞浸潤；模型組大鼠結(jié)腸隱窩細胞丟失，炎癥細胞浸潤深入黏膜肌層；經(jīng)靛玉紅及陽性藥物SASP干預(yù)后，UC模型大鼠結(jié)腸中性粒細胞及淋巴細胞浸潤較模型組少，可見少量腺管扭曲。

3.3靛玉紅對UC模型大鼠TGF-β1水平的影響對各組大鼠結(jié)腸組織TGF-β1水平進行測定，如Fig 3所示，與模型組比較，靛玉紅組及SASP組TGF-β1水平均明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

3.4靛玉紅對UC模型大鼠ITFmRNA水平的影響如Fig 4所示，與模型組比較，ITF mRNA的相對表達量在靛玉紅組及SASP組中均有明顯升高(P<0.01)。

Fig 2 Representative HE-stained colon sections(×100)

Fig 3 Changes of colonic tissue levels

##P<0.01vsnormal;**P<0.01vsmodel

4 討論

UC屬于中醫(yī)學(xué)“泄瀉”、“休息痢”、“腸澼”等范疇，其發(fā)病機制尚不十分明確，有報道稱可能是由于促炎性因子增多和抗炎性因子減少所導(dǎo)致[10]。而目前對于本病的研究熱點也集中在抑制炎癥因子釋放，從而達到減輕炎癥的目的[11]。

UC發(fā)生時，常伴炎性因子水平的升高，研究顯示，直腸黏膜TGF-β1水平與UC患者疾病活動性呈正相關(guān)[12]。TGF-βl是一種通過免疫和非免疫細胞產(chǎn)生的細胞因子,具有廣泛的作用,其控制著免疫細胞的分化、增殖、激活、創(chuàng)傷修復(fù)、血管生成,而且與免疫異常有關(guān),如腫瘤、自身免疫性疾病、IBD等[13]。因此，TGF-β1 常作為評價UC炎癥程度的重要指標。ITF是三葉因子家族(trefoil factor family，TFF)成員之一，具有黏膜保護、修復(fù)、抑制炎癥介質(zhì)反應(yīng)、調(diào)節(jié)細胞免疫和細胞凋亡等功能。它由腸黏膜上皮杯狀細胞分泌，廣泛存在于胃腸道，具有特征性的三葉結(jié)構(gòu)，被認為是內(nèi)源性具有抗凋亡特性的肽類物質(zhì)[14-15]，在腸道的自我保護和損傷后修復(fù)中占有重要地位。

Fig 4 Changes of colonic tissue expressionof ITF mRNA in

#P<0.05vsnormal;**P<0.01vsmodel

本研究顯示，靛玉紅有明顯的抑制炎癥的作用，能夠有效降低DAI評分，明顯改善UC大鼠癥狀，減輕UC大鼠模型受損腸組織的炎性反應(yīng)。在對結(jié)腸的HE染色病理觀察中，靛玉紅可明顯減少炎癥細胞，表明靛玉紅對UC有治療作用。與模型組比較，靛玉紅可以降低TGF-β1水平，提高ITF mRNA表達，說明靛玉紅可以降低UC大鼠炎癥水平，其抑制UC大鼠炎癥的可能原因是抗細胞凋亡，而其抗細胞凋亡的具體途徑有待進一步研究。

(致謝：本實驗主要在遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室完成，感謝遼寧中醫(yī)藥大學(xué)孟憲生教授的悉心教誨。)