黃惠麗，謝 銘，高 麗，張文慧，陳可塑，劉福明，陳 龍,4

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，國家科技部規(guī)范化中藥藥理實驗室，江蘇 南京 210023；2. 南京軍區(qū)總醫(yī)院干部病房呼吸科，江蘇 南京 210002；3. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇省中醫(yī)院心臟內(nèi)科，江蘇 南京 210029；4. 泰州中國醫(yī)藥城中醫(yī)藥研究院，江蘇 泰州 225300)

目前臨床使用的正性肌力藥物有β受體激動劑、磷酸二酯酶Ⅲ型抑制劑、Na+-K+-ATP酶抑制劑及鈣增敏劑[1]。但目前的正性肌力藥物并沒有針對心衰準(zhǔn)確的病理基礎(chǔ)的靶點，其臨床使用特點為：用于治療急性期心衰、治療安全窗口窄以及長期使用療效不確定或有害[2]。蛋白磷酸酶(protein phosphatase, PP)是一種與蛋白激酶A ( protein kinase A, PKA)相對應(yīng)存在的酶分子，能夠催化被PKA磷酸化的蛋白質(zhì)發(fā)生去磷酸化反應(yīng)，與PKA構(gòu)成了控制體內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化的開關(guān)系統(tǒng)。心肌細(xì)胞內(nèi)存在2種亞型的蛋白磷酸酶，分別為蛋白磷酸酶1和2A(PP1、PP2A)，抑制其活性能夠產(chǎn)生正性肌力作用。過度抑制磷酸酶并沒有使心肌肥厚的小鼠心功能改善，反而加速其心功能惡化[3]。也有實驗表明，PKA過度上調(diào)極易引起蘭尼堿受體2 (ryanodine receptor 2, RyR2)的過度磷酸化，導(dǎo)致心肌細(xì)胞舒張期出現(xiàn)Ca2+滲漏現(xiàn)象，誘發(fā)心律失常，不利于心力衰竭的治療[4]?；ㄝ嗪＞d誘癌素 (Calyculin A，CA)是一種從海綿中提取出來的細(xì)胞毒素，為PP1和PP2A特異性的抑制劑[5-6]。Calyculin A明顯增加心肌細(xì)胞L型鈣電流[7]及大鼠心室肌的收縮力[8]。然而，Calyculin A對大鼠心臟血流動力學(xué)及其心肌細(xì)胞鈣釋放的作用尚未見報道，本文通過對Calyculin A的研究，初步判斷PP1、PP2A能否作為靶點，開發(fā)正性肌力藥物。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑Calyculin A(批號：101932-71-2，規(guī)格：25 μg，Genne Operation公司)；鈣熒光指示劑Fluo-3購于東仁化學(xué)科技(上海)有限公司；實驗溶液配制的試劑購于Sigma公司。

1.2儀器PowerLab 8/35多導(dǎo)生理記錄儀(AD Instruments)；35-2083 Rev.F Millar放大器、SPR-901(大鼠) Millar心室內(nèi)壓和壓力容積導(dǎo)管(美國MILLAR公司)；Olympus IX53倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；ZYLA-5.5-CL3科研級高靈敏致冷CCD(英國ANDOR公司)；Lambda DG-4超高速波長切換裝置(美國Sutter)；VC3-8灌流給藥系統(tǒng)(美國ALA公司)。

1.3實驗動物普通SD大鼠，♂，體質(zhì)量250～300 g，購于南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK(蘇) 2012-0008，實驗動物使用許可證：SYXK(蘇) 2011-0053。在恒溫、各12 h明暗周期的飼養(yǎng)室自由進(jìn)食和飲水。

1.4在體大鼠心臟及血管血流動力學(xué)參數(shù)記錄Calyculin A對PP1半數(shù)抑制量(IC50)為2 nmol·L-1，對PP2A的IC50為0.5～1.0 nmol·L-1[9]。本實驗采用4 nmol·L-1，按外液占重量的20%計算，Calyculin A的用量即0.8 μg·kg-1。健康清潔級♂SD大鼠，使用20%烏拉坦(5 mL·kg-1)進(jìn)行腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥位固定，分離右側(cè)頸總動脈及左側(cè)頸靜脈，再定標(biāo)Millar壓力容積導(dǎo)管自右頸總動脈插入左心室(過程中根據(jù)生理記錄儀壓力波形變化判斷導(dǎo)管位置)，然后藥物經(jīng)左側(cè)頸靜脈緩慢推注，并記錄左心室壓力-容積環(huán)(P-V loop)及主動脈壓。實驗數(shù)據(jù)采用AD Instruments的Labchart 8軟件分析。實驗結(jié)束后，自頸靜脈推注30%高滲鹽水20～50 μL，并取大鼠自身血液進(jìn)行容積定標(biāo)。血流動力學(xué)指標(biāo)包括：心輸出量(cardiac output，CO)、心率(heart rate，HR)、射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)、每搏輸出量(stroke volume，SV)、左心室搏出功(stroke work，SW)、收縮末期容積(end-systolic volume，Ves)、舒張末期容積(end-diastolic volume，Ved)、收縮末期壓力(end-systolic pressure，Pes)、舒張末期壓力(end-diastolic pressure，Ped)、左心室收縮彈性(end-systolic elastance, Ees)或左心室收縮末期壓力-容積關(guān)系曲線斜率(the slope of the left ventricular end-systolic P-V relationship)、左心室舒張末期彈性(end-diastolic elastance, Eed)或左心室舒張末期壓力-容積關(guān)系曲線斜率(the slope of the left ventricular end-diastolic P-V relationship)、舒張壓(diastolic blood pressure, DBP)、收縮壓(systolic blood pressure, SBP)、脈壓差(pulse pressure, PP)。

1.5大鼠心肌細(xì)胞分離動物及麻醉同在體實驗。大鼠開胸迅速取出心臟，置于(0～4)℃無鈣灌流液中使其停搏。修剪組織分離主動脈，將心臟掛在改良Langendorff逆行性灌流系統(tǒng)裝置上，在溫度為(37.5 ± 0.5)℃，充氧(95% O2+ 5% CO2)，灌流壓90 cm H2O (1 cm H2O=0.098 kPa)條件下，經(jīng)主動脈逆行灌流無鈣臺氏液。等心臟變軟松弛后，用含酶(胰蛋白酶0.1 g·L-1+膠原酶Ⅱ型2 g·L-1)無鈣灌流液20 mL反復(fù)灌流30 min至心臟膨大、松弛后，換KB液沖洗5 min終止消化。取下心臟放置在盛有KB液的玻璃表面皿中，將其充分剪碎，經(jīng)直徑200 μm的尼龍網(wǎng)過濾得到細(xì)胞懸液，靜置放室溫備用。無鈣臺氏液組成(mmol·L-1): NaCl 117、KCl 5.7、NaHCO34.4、MgCl21.7、HEPES 20、NaH2PO41.5、葡萄糖11，pH用NaOH調(diào)至7.40。KB液組成(mmol·L-1): KCl 25、NaH2PO410、葡萄糖11、KOH 85、L-谷氨酸70、?；撬?0、EGTA 0.5、HEPES 5，pH用KOH調(diào)至7.40。

1.6離子影像測定大鼠左心室心肌細(xì)胞鈣瞬變左心室心肌細(xì)胞用KB液沖洗3次后，加入鈣熒光指示劑Fluo-3 (5 μmol·L-1)，恒溫37℃避光孵育30 min。將孵育好的心肌細(xì)胞放在灌流槽中，用細(xì)胞外液持續(xù)灌流沖洗。局部場刺激由刺激器通過一對刺激電極(末端為裸露的白金絲)以0.2 Hz 、10 V強(qiáng)度的脈沖電刺激加于心肌細(xì)胞兩側(cè)，刺激細(xì)胞收縮。單色激發(fā)光源發(fā)出激發(fā)光，通過耦合系統(tǒng)引入熒光顯微鏡，聚焦到細(xì)胞平面，激發(fā)細(xì)胞中的熒光探針發(fā)出熒光，用空氣冷卻CCD相機(jī)采集并記錄熒光信號。吸收波長510 nm，激發(fā)波長488 nm。

2 結(jié)果

2.1CalyculinA對大鼠左心室收縮動力學(xué)的作用與正常對照組相比，Calyculin A (0.8 μg·kg-1)能夠增加SW、CO、SV、Ves、Pes、EF。結(jié)果見Tab 1、Fig 1。

Fig 1 Representative effective curves of Calyculin A (0.8 μg·kg-1) on P-V loop from normal rat left ventricle

2.2CalyculinA對大鼠左心室內(nèi)在收縮性能的影響左心室收縮末期壓力-容積(ESPVR)曲線斜率(end-systolic elastance, Ees)和舒張末期壓力-容積(EDPVR)曲線斜率(end-diastolic elastance, Eed)反映了心室收縮特性與舒張?zhí)匦?。Fig 2A、2B為阻斷下腔靜脈后，Calyculin A (0.8 μg·kg-1)加藥前后對ESPVR及EDPVR關(guān)系曲線變化影響的代表性曲線；Fig 2C、2D為Calyculin A (0.8 μg·kg-1)對ESPVR及EDPVR關(guān)系曲線的斜率統(tǒng)計直方圖。實驗結(jié)果表明，Calyculin A (0.8 μg·kg-1)能夠同時提高大鼠心室收縮(Ees值增加)與舒張性功能(Eed值下降)，這種作用與回心血量(心肌初長度)無關(guān)。

Tab 1 Effects of Calyculin A on normal rat heart hemodynamic parameters in vivo n=4)

bpm: beats per minute.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.3CalyculinA對大鼠動脈壓及心室-血管耦合性的影響外周阻抗可以歸納成1個單一的變量-動脈阻抗Ea (arterial elastance)，即單位容量變化帶來的壓力變化，數(shù)值上Ea=Pes/SV。Ea/Ees比值即反映了心室收縮和動脈系統(tǒng)阻抗作用相互匹配的程度，稱為心室-血管耦聯(lián)(ventricular-arterial coupling)。Calyculin A (0.8 μg·kg-1)明顯增加收縮壓(與之對應(yīng)的左室內(nèi)壓)、舒張壓及脈壓差(P<0.01)，降低動脈阻抗Ea(P<0.05)，提高心室-血管耦聯(lián)程度(P<0.01)。結(jié)果見Fig 3、Tab 2。

Tab 2 Effects of Calyculin A (0.8 μg·kg-1) on rat arterial blood pressure, pulse pressure, arterial elastance and ventricular-arterial n=4)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.4CalyculinA對大鼠左心室心肌細(xì)胞鈣釋放的影響Calyculin A(100 nmol·L-1)明顯降低標(biāo)準(zhǔn)化的舒張期胞質(zhì)鈣濃度(diastolic Ca2+concentration) (P<0.01)，明顯增加標(biāo)準(zhǔn)化的鈣釋放幅值(amplitude of Ca2+release) (P<0.01)，明顯縮短標(biāo)準(zhǔn)化的鈣回吸收時間常數(shù)值(time constant,τ) (P<0.05)。結(jié)果見Fig 4、Tab 3。

Fig 3 Representative effective curves of Calyculin A on rat left ventricular pressure (A), systolic blood pressure and diastolic blood pressure (B)

3 討論

雖然能夠發(fā)揮正性肌力作用的化合物數(shù)量眾多，作用于心臟的靶點各異，但真正用于臨床治療心力衰竭的正性肌力藥物很少。其原因是藥物在發(fā)揮正性肌力作用的同時，會不成比例地增加心肌耗氧量。蛋白磷酸酶(PP1、PP2A)是參與肌漿網(wǎng)鈣釋放及再吸收的重要環(huán)節(jié)，通過去磷酸化作用，使得肌漿網(wǎng)受磷蛋白(PLB-16、PLB-17)去磷酸化。而去磷酸化的PLB對肌漿網(wǎng)鈣泵(SERCA2a)產(chǎn)生抑制作用，引起胞質(zhì)內(nèi)的鈣回吸收的能力下降。而蛋白磷酸酶(PP1、PP2A)抑制劑Calyculin A抑制蛋白磷酸酶(PP1、PP2A)的活性，增加受磷蛋白(PLB-16、PLB-17)的磷酸化，解除受磷蛋白對SERCA2a的抑制作用，實現(xiàn)其正性肌力作用。受磷蛋白的磷酸化受PKA及鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ, CaMKⅡ)的調(diào)控[10]。有關(guān)Calyculin A的亞細(xì)胞水平的研究報道很多，分子機(jī)制已非常明確，但在整體動物水平，Calyculin A對心臟的血流動力學(xué)研究鮮有報道。本研究較為清楚地闡明了基于蛋白磷酸酶(PP1、PP2A)靶點的Calyculin A發(fā)揮良好的血流動力學(xué)作用，且無增加心率的作用，增加心肌鈣釋放，也進(jìn)一步佐證了Calyculin A是通過增強(qiáng)肌漿網(wǎng)鈣泵活性，發(fā)揮其正性肌力作用。

Fig 4 Representative curves of before (A) and after (B) Calyculin A on Ca2+ transients from normal rat left ventricular myocytes with one exponential (three parameters) fitting used to analyze time constant (τ)

Tab 3 Effects of Calyculin A (100 nmol·L-1) on Ca2+ transient from rat left ventricular n=4)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

本研究采用雙壓力P-V loop技術(shù)，同時測定左心室的壓力-容積的關(guān)系，以及主動脈的壓力變化。該技術(shù)是分析藥物對心血管血流動力學(xué)作用的重要手段。實驗表明，Calyculin A不僅增加心肌收縮力，還能增加心肌內(nèi)在收縮性能(增加心室收縮末期壓力-容積ESPVR曲線斜率，Ees)以及增加心室的彈性(降低心室舒張末期壓力-容積曲線斜率，Eed)；提高心室射血的動力與動脈的阻力相互匹配程度。Ees反映心室的收縮性能，Ea反映動脈系統(tǒng)的阻抗，Ea與Ees的合理匹配才能夠發(fā)揮心血管之間的最大效能。因此，Ea/Ees比值反映了動脈系統(tǒng)阻抗和心室收縮作用相互匹配的程度，稱為心室-血管耦聯(lián)(ventriculo-arterial coupling) 。研究表明，只有當(dāng)Ea接近Ees時(其比值介于0.8～1.1)，心室做功才能達(dá)到最佳狀態(tài)，耗能最低[11-12]。

心肌細(xì)胞鈣釋放興奮-收縮耦聯(lián)的中心環(huán)節(jié)，其上游是心肌動作電位觸發(fā)Ca2+誘導(dǎo)的Ca2+釋放，其下游是肌漿網(wǎng)釋放的Ca2+觸發(fā)肌小節(jié)收縮。作為中心環(huán)節(jié)的Ca2+釋放是通過肌漿網(wǎng)RyR2受體，將肌漿網(wǎng)中高濃度的鈣釋放到胞質(zhì)。而舒張期Ca2+回吸收主要通過肌漿網(wǎng)的Ca2+泵(SERCA2a)回吸收到肌漿網(wǎng)(約占90%)，其余約10%主要通過細(xì)胞膜上鈉-鈣交換體(Na+-Ca2+exchanger, NCX)及細(xì)胞膜上鈣泵(plasma membrane Ca2+-ATPase, PMCA) 經(jīng)細(xì)胞膜外排到胞外，實現(xiàn)在興奮期經(jīng)Ca2+通道進(jìn)入胞內(nèi)等量的Ca2+再次排出細(xì)胞[13-14]。Calyculin A不僅增加Ca2+釋放的幅值，還能降低舒張期胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+濃度。通過對回吸收下降曲線的單指數(shù)擬合，發(fā)現(xiàn)Calyculin A能明顯降低回吸收曲線的時間常數(shù)(τ)。時間常數(shù)(τ)是反映曲線下降的速率，而該速率主要是肌漿網(wǎng)鈣泵構(gòu)成的。由此可以推論：Calyculin A通過增強(qiáng)Ca2+泵活性增加舒張期Ca2+的回吸收，實現(xiàn)降低胞質(zhì)鈣濃度的作用；Ca2+泵活性增加后提升肌漿網(wǎng)內(nèi)的Ca2+濃度，進(jìn)一步提高肌漿網(wǎng)與胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+濃度差，而差值導(dǎo)致進(jìn)一步增加Ca2+釋放的幅值。

綜上所述，Calyculin A基于靶點蛋白磷酸酶(PP1、PP2A)，通過增加肌漿網(wǎng)Ca2+泵活性，實現(xiàn)其正性肌力作用，該正性肌力作用是基于Ca2+泵活性增強(qiáng)的基礎(chǔ)上。蛋白磷酸酶(PP1、PP2A)可作為靶點開發(fā)正性肌力藥物，用于治療心力衰竭。