高緒聰，孫程穎，韓利文，韓 建，申秀萍

(1. 天津藥物研究院新藥評價(jià)有限公司GLP實(shí)驗(yàn)室，天津 300301；2. 天津市新藥非臨床評價(jià)技術(shù)工程中心GLP實(shí)驗(yàn)室，天津 300301；3. 山東省科學(xué)院生物研究所藥物篩選技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014)

斑馬魚作為一種公認(rèn)的新型模式生物，目前被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、環(huán)境等多個(gè)研究領(lǐng)域[1-2]。在斑馬魚實(shí)驗(yàn)中，檢測終點(diǎn)和染毒頻率不同，可能導(dǎo)致被檢物的毒性表現(xiàn)發(fā)生明顯差異，從而影響被檢物毒性的準(zhǔn)確判斷。目前各領(lǐng)域?qū)Π唏R魚檢測終點(diǎn)的選取未形成共識(shí)[1,3-5]，染毒頻率的設(shè)定也參差不齊[2,4]。本研究針對檢測終點(diǎn)和染毒頻率建立驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，闡明其對斑馬魚藥物評價(jià)模型的影響，嘗試摸索最佳實(shí)驗(yàn)方法，為更好地進(jìn)行藥物毒性的早期篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑SZX16型體視熒光顯微鏡、DP2-BSW圖像采集系統(tǒng)(Olympus公司)；斑馬魚養(yǎng)殖飼養(yǎng)系統(tǒng)(北京愛生科技有限公司)。全反式維甲酸(all-transretinoic acid，ATRA，Sigma公司)；抗壞血酸(ascorbic acid，AA，天津市化學(xué)試劑供銷公司)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，生工生物工程上海股份有限公司)；三卡因(化學(xué)名3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽，F(xiàn)luka公司)；鈣黃綠素(Sigma公司)。DMSO配制成儲(chǔ)備液，-20℃保存?zhèn)溆?，使用前用斑馬魚胚胎培養(yǎng)用水(5 mmol·L-1NaCl、0.17 mmol·L-1KCl、0.4 mmol·L-1CaCl2、0.16 mmol·L-1MgSO4)稀釋為70 mmol·L-1用于實(shí)驗(yàn)。

1.2魚卵制備健康性成熟的AB系斑馬魚所產(chǎn)受精卵，于受精2 h時(shí)經(jīng)脫膜處理后，挑選受精6 h的健康脫膜斑馬魚胚胎用于實(shí)驗(yàn)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)共設(shè)9組，分別為空白對照組(胚胎培養(yǎng)用水)、溶劑對照組(DMSO，70 mmol·L-1)、陰性藥物組(AA，10 mg·L-1)、陽性藥物組(ATRA設(shè)置6個(gè)檢測濃度：0.625、1.25、2.5、5.0、7.5、10 μg·L-1)。斑馬魚胚胎移入6孔培養(yǎng)板中，每孔30枚，每組3個(gè)重復(fù)孔。每24 h更換4/5的藥液，連續(xù)染毒5 d。每天計(jì)數(shù)死亡受精卵和幼魚數(shù)，計(jì)算累積死亡率，對照組累積死亡率應(yīng)不高于10%。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，顯微鏡下觀察存活幼魚自主活動(dòng)情況；利用1 mmol·L-1三卡因麻醉幼魚，固定焦距對側(cè)面、背面照相，首先對每條存活幼魚的形態(tài)發(fā)育進(jìn)行鏡下觀察，隨后每組選擇6條幼魚對體節(jié)、脊索、尾、鰭(胸鰭、背鰭、腹鰭、尾鰭)、腦、上面部結(jié)構(gòu)(眼、耳囊、嗅區(qū))、下面部結(jié)構(gòu)(上下顎)、心臟、體形、肝、鰾的發(fā)育進(jìn)行評分，并根據(jù)各組織器官評分情況，對每條斑馬魚進(jìn)行總體評分[6]。將麻醉的幼魚用3.2 mmol·L-1的鈣黃綠素溶液染色，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)魚體中具有熒光染色的脊椎骨(礦化椎骨)并拍照。

1.4觀察時(shí)間研究另取9組斑馬魚胚胎，在染毒5 d時(shí)去掉藥液，加入胚胎培養(yǎng)用水，至d 7結(jié)束實(shí)驗(yàn)，觀察斑馬魚幼魚發(fā)育情況。其他實(shí)驗(yàn)方法同“1.3”項(xiàng)。

1.5換液頻率研究另取9組斑馬魚胚胎，在d 1時(shí)加入藥液，實(shí)驗(yàn)期間不換液，在染毒5 d時(shí)結(jié)束實(shí)驗(yàn)，觀察幼魚發(fā)育情況。其他實(shí)驗(yàn)方法同“1.3”項(xiàng)。

2 結(jié)果

2.1對死亡率的影響如Tab 1所示，空白對照組、溶劑對照組和陰性藥物組平均死亡率均<10%，但5 d不換液實(shí)驗(yàn)的死亡率較換液實(shí)驗(yàn)略有升高。ATRA各給藥組，給藥5 d每天換液和不換液實(shí)驗(yàn)各組的死亡率均≤10%，但不換液實(shí)驗(yàn)大部分組別的死亡率略低；7 d換液實(shí)驗(yàn)，0.625、1.25、2.5、5.0 μg·L-1組死亡率較低，能保證有足夠數(shù)量的胚胎用于發(fā)育評價(jià)，7.5、10 μg·L-1兩組死亡率明顯升高。

Tab 1 Cumulative mortality of zebrafish(%,

**P<0.01vsDMSO

2.2對自主活動(dòng)的影響空白對照組、溶劑對照組和陰性藥物組存活幼魚均能自由游動(dòng)；ATRA給藥組存活幼魚，低濃度下僅部分個(gè)體游動(dòng)遲緩，隨濃度增加，游動(dòng)能力逐漸喪失至無法正常游動(dòng)。觀察時(shí)間和換液頻率對存活幼魚自主活動(dòng)的影響不明顯。

2.3對形態(tài)發(fā)育的影響3種實(shí)驗(yàn)方法中，空白對照組、溶劑對照組和陰性藥物組存活斑馬魚無明顯畸形，僅見陰性藥物組個(gè)別斑馬魚的體形、尾部、胸鰭、心出現(xiàn)發(fā)育延遲；ATRA經(jīng)梯度濃度暴露后，呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)劑量-效應(yīng)關(guān)系。如Fig 1所示，在給藥5 d換液實(shí)驗(yàn)中，0.625、1.25、2.5 μg·L-1組斑馬魚僅鰭條有輕微的邊緣不規(guī)則，尾部輕微彎曲，頭部形態(tài)輕微異常，如腦部比例的微小變化；5.0 μg·L-1組脊索和體節(jié)不規(guī)則，靠近尾部的體節(jié)發(fā)育受阻，尾部嚴(yán)重彎曲，鰭條發(fā)育不全，頭部嗅區(qū)發(fā)育受阻，腦部發(fā)育尺寸異常，心臟、肝臟部位發(fā)育異常，鰾發(fā)育不全或不充氣，個(gè)別個(gè)體出現(xiàn)水腫；7.5、10 μg·L-1組嚴(yán)重畸形，水腫嚴(yán)重，脊索和體節(jié)不規(guī)則、不明晰，部分體節(jié)缺失，尾部扭曲，鰭條發(fā)育不全，兩側(cè)胸鰭嚴(yán)重異常、變小、不規(guī)則，眼睛小，上下顎、嗅區(qū)、耳蝸、腦部嚴(yán)重變形，各部位尺寸和比例失調(diào)，心臟、肝臟部位難以辨清，10 μg·L-1組比7.5 μg·L-1組畸形程度略嚴(yán)重。延長觀察時(shí)間后，5.0、7.5、10 μg·L-1組部分個(gè)體腹部或尾部出現(xiàn)異常增生，7.5、10 μg·L-1組水腫程度略加重，總體評分可見2.5、5.0 μg·L-1組評分降低。不換液實(shí)驗(yàn)中，可見各組畸形程度略輕，5.0、7.5 μg·L-1組總體評分有所升高。評分結(jié)果見Tab 2。

2.4對骨骼發(fā)育的影響空白對照組、溶劑對照組、陰性藥物組均有一定數(shù)量的椎骨發(fā)生鈣化，7 d實(shí)驗(yàn)的空白對照和溶劑對照組斑馬魚礦化椎骨數(shù)較5 d實(shí)驗(yàn)有所增加。給藥5 d換液與不換液實(shí)驗(yàn)中，ATRA各給藥組的礦化椎骨數(shù)均為零，可見ATRA抑制斑馬魚的骨骼鈣化，但未能體現(xiàn)劑量效應(yīng)；在7 d換液實(shí)驗(yàn)中，ATRA 0.625、1.25 μg·L-1給藥組幼魚出現(xiàn)少量礦化椎骨，呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。見Tab 3。

Fig 1 Development of zebrafish in ATRA treated groups

Tab 2 Total scores of zebrafish morphological

*P<0.05,**P<0.01vscontrol, DMSO and AA

Tab 3 Number of mineralized vertebrae of n=6)

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsAA

3 討論

斑馬魚作為新的模型動(dòng)物，具有周期短、投入少等諸多優(yōu)勢，但較大鼠、小鼠、家兔等成熟動(dòng)物模型，還有很多不確定因素需要摸索和探討。斑馬魚受精卵48～72 h即可孵化成魚，但剛孵出的幼魚器官發(fā)育尚不完全成形、游動(dòng)能力低，不利于發(fā)育評價(jià)和自主活動(dòng)的觀察。因此，本實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)染毒周期和觀察時(shí)間定為受精后1～5 d，覆蓋胚胎早期發(fā)育和各器官形成期；并在5 d染毒實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對斑馬魚模型的觀察終點(diǎn)和染毒頻率進(jìn)行探討性研究。

在染毒5 d后延長觀察2 d的實(shí)驗(yàn)中，斑馬魚死亡率較5 d實(shí)驗(yàn)升高、形態(tài)發(fā)育畸形程度加重，可見毒性作用的延遲表達(dá)。5.0 μg·L-1染毒濃度下，ATRA對斑馬魚的致畸程度已與5 d實(shí)驗(yàn)中7.5 μg·L-1基本一致，兩組總體評分相同，可見適當(dāng)延后觀察終點(diǎn)會(huì)使評價(jià)物的毒性劑量降低、毒性等級升高，對被檢物的安全性判定更加謹(jǐn)慎，同時(shí)也趨向保守。另外由骨骼發(fā)育結(jié)果可知，5 d染毒實(shí)驗(yàn)雖然可呈現(xiàn)ATRA對椎骨礦化的抑制，但由于對照組的礦化椎骨數(shù)即較少，并無劑量-效應(yīng)關(guān)系，受骨骼發(fā)育階段的影響較大；將觀察時(shí)間適當(dāng)延長后，可顯示不同給藥量下的劑量-效應(yīng)關(guān)系，能更好地呈現(xiàn)藥物對骨骼發(fā)育的影響，因此在需要觀察骨骼發(fā)育情況的評價(jià)研究中，觀察終點(diǎn)的適當(dāng)延后更加必要。

在染毒5 d不換液實(shí)驗(yàn)中，兩個(gè)對照組的死亡率較換液實(shí)驗(yàn)略偏高，可見換液頻率對斑馬魚的發(fā)育質(zhì)量有一定的影響。同時(shí)各對照組的死亡率皆不超過10%，從一個(gè)側(cè)面說明斑馬魚對培育環(huán)境要求較低，使斑馬魚模型的廣泛推廣應(yīng)用成為可能。該實(shí)驗(yàn)ATRA染毒斑馬魚死亡率較換液實(shí)驗(yàn)偏低、形態(tài)發(fā)育畸形程度減弱、明顯致畸劑量升高(10 μg·L-1)，可見藥物毒性作用表達(dá)不充分。同時(shí)，對照組死亡率偏高，又降低了毒性作用的檢出概率，使被檢物的毒性判定較實(shí)際偏低，增加了藥物研發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，使用斑馬模型進(jìn)行藥物毒性的早期篩選時(shí)，在染毒時(shí)間貫穿胚胎發(fā)育全程、規(guī)律重復(fù)染毒的基礎(chǔ)上，適當(dāng)增加觀察時(shí)間有利于毒性作用的充分表達(dá)，尤其在需要進(jìn)行骨骼發(fā)育評價(jià)時(shí)變得更加必要。但延長觀察時(shí)間可能使毒性劑量/濃度降低、毒作用增強(qiáng)，使檢測結(jié)果趨向保守，在藥物研發(fā)過程中對預(yù)期前景的瞻望應(yīng)考慮該因素的影響。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在山東省科學(xué)院生物研究所藥物篩選技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝張?jiān)?、何秋霞等老師的指?dǎo)和幫助!)