陳竹芳 莫俊杰 胡漢橋 甄珍 藺中 任磊*

摘? 要：廣泛存在于植物中的酚類物質(zhì)具有許多重要功能。本研究收集了不同地區(qū)32個芋頭（Colocasia Esculenta）品種，鑒定了它們對疫霉菌（Phytophthora colocasiae）的抗性，選取抗感不同的7個芋頭品種用高效液相色譜法測定芋頭中酚類物質(zhì)的種類及其含量。結(jié)果表明不同芋頭品種對疫霉菌的抗性差異顯著，大多數(shù)品種感病，2個抗病。芋頭中含沒食子酸和蘆丁，不同芋頭品種中沒食子酸和蘆丁含量差異顯著。葉片沒食子酸的含量在 529.4～1910.8 ng/g;葉片蘆丁的含量在12247.7～91189.6ng/g之間。沒食子酸和蘆丁的含量與芋頭的抗病性沒有相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：芋頭;疫霉菌;高效液相色譜;沒食子酸;蘆丁

中圖分類號：S-3? ? ? ? ? ? ? ? ?? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.11974/nyyjs.20181032002

芋頭（Colocasia esculenta（L.）schott），又稱芋艿，屬南星科多年生草本植物芋的地下塊莖，是一些熱帶或亞熱帶地區(qū)人們的主要食品。芋頭的種植量在食根作物中位于馬鈴薯、木薯、甘薯和山藥之后，位列第五。芋頭依食用部位不同，分為葉用變種及球莖變種。栽培的芋頭品種主要分為2種類型：魁芋類，2倍體，植株高大，食母芋為主;多子芋類，3倍體，子芋大而多[1]。芋頭疫病由芋疫霉菌（Phytophthora colocasiae Racib）侵染所致。疫病是芋頭生產(chǎn)過程中的一種主要限制因素，可引起芋頭減產(chǎn)25%～30%[2]。

植物酚類化合物是植物次生代謝物的主要類型之一，在植物體內(nèi)具有重要的作用。植物體內(nèi)的酚類物質(zhì)以自由和共價的形式存在，自由的酚類物質(zhì)稱為可溶性酚[3]。已發(fā)現(xiàn)芋頭中總的可溶性酚類物質(zhì)的含量與芋頭疫病的抗性相關(guān)[4]。

本研究收集了不同地區(qū)的芋頭品種，鑒定了它們對疫霉菌的抗病性，選取疫病抗性不同的芋頭品種，用高效液相色譜法測定芋頭葉片中酚類物質(zhì)的種類和含量，探討它們與芋頭抗病的相關(guān)性。

1? ? ?材料與方法

1.1? ? ?材料與試劑

選取廣東省、廣西省和湖南省芋頭32品種進(jìn)行抗病性鑒定。阿魏酸、白藜蘆醇、對香豆酸、綠原酸、蘆丁、沒食子酸、楊梅素、肉桂酸和鞣花酸均購自Sigma Aldrich 公司。甲醇、乙酸、乙腈購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（均為色譜純級）。水為娃哈哈牌純凈水。

1.2? ? ?儀器設(shè)備

Agilent 1200高效液相色譜儀;真空干燥箱（上海之信儀器有限公司）。

1.3? ? ?方法

1.3.1? ? ?芋頭的疫病抗病性鑒定

芋頭疫病抗性參考Brooks [2]的方法進(jìn)行，稍作改進(jìn)。培養(yǎng)3～5d的疫霉菌打出直徑為0.5cm的菌塊。接種于第2或第3最嫩的葉片的背面，用透明膠封住菌塊，接種5d后，測定病斑的直徑，作為芋頭抗疫霉菌的標(biāo)準(zhǔn)。每個材料接種3張葉片?？共¤b定于2016年在廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行。

1.3.2? ? ?標(biāo)準(zhǔn)儲備液

稱取色譜純級別的沒食子酸0.05g，置于10mL的容量瓶中，加入甲醇（色譜純）溶解，定容。濃度為5000mg/L。然后經(jīng)0.2μm孔徑的濾膜過濾后置于4℃冰箱中避光保存，作為貯備液;使用時用甲醇（色譜純）稀釋500倍。終濃度為10μg/mL。阿魏酸、白藜蘆醇、對香豆酸、綠原酸、蘆丁、楊梅素、肉桂酸和鞣花酸的配制方法同沒食子酸，終濃度為100μg/mL。

1.3.3? ? ?樣品前處理

選芋頭最嫩葉片0.5g，加液氮充分研磨，按De Ascensao的方法提取可溶性酚類物質(zhì)[5]。

1.3.4? ? ?色譜條件

色譜柱：Agilent XDB-C 18 柱（4.6mm×150mm，5μm）;流動相：乙腈與10%乙酸溶液，梯度洗脫：0 min → 10min→20min→30min → 40min→55min，乙腈35% →40%→ 55% → 80%→0;檢測波長：280 nm;流速：1.0 mL/min;柱溫：30℃;進(jìn)樣量：10μL。

2? ? ?結(jié)果與分析

2.1? ? ?芋頭的疫病抗病性

分離出疫霉菌后，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及分子鑒定確定為疫霉菌，以此菌作為接種的病原菌。接種后測定病斑的直徑，以其病斑直徑的大小作為衡量芋頭抗病性的指標(biāo)。通過方差分析，差異極顯著，表明不同芋頭品種之間的抗病性存在極顯著差異。參考Singh等[6]離體鑒定芋頭疫病的抗性指標(biāo)，將田間芋頭抗病性的標(biāo)準(zhǔn)定為：直徑小于0.20 cm為抗病，0.21～0.40 cm為中等抗病，大于0.40 cm為感病。不同類型的品種中，魁芋有9個，除3個表現(xiàn)中抗外，其余均感病;而在22個多仔芋中，感病12個，中抗9個，抗病2個。從這里可以看出芋頭品種中抗病品種較少，魁芋比多仔芋的抗病性差。選取抗性不同類型的材料用于測定有機(jī)酸的含量。

2.2? ? ?芋頭不同抗性樣品有機(jī)酸種類的測定

將各標(biāo)樣分別取10μl進(jìn)樣，重復(fù)測定3次，測定各自的保留時間。將抗病品種湘潭-1和感病品種湛江-5的有機(jī)酸的提取物分別取10μl進(jìn)樣，每個樣品重復(fù)測定3次。標(biāo)樣中沒食子酸的保留時間為3.433±0.00;蘆丁標(biāo)樣的保留時間為11.854±0.02。而湘潭-1和湛江-5分別出現(xiàn)了保留時間為3.449±0.04、3.394±0.01和11.909±0.02和 11.935±0.00的峰值，說明芋頭中含有沒食子酸和蘆丁。芋頭沒有其它種類的酚類物質(zhì)，結(jié)果見圖1。

（a.標(biāo)準(zhǔn)品;b.提取樣品;1.沒食子酸;2.蘆丁）

2.3? ? ?標(biāo)準(zhǔn)品譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別取沒食子酸和蘆丁5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、35μl，測定峰面積。對進(jìn)樣量和峰面積進(jìn)行線性回歸，沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y（峰面積）=1509.5X （進(jìn)樣量）+10.7（R2=0.9972）;蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=3480.6X-2567.6（R2=0.9992）。沒食子酸和蘆丁的進(jìn)樣量與峰面積相關(guān)極顯著。

2.4? ? ?芋頭沒食子酸含量的測定

測定得到各樣品中沒食子酸和蘆丁的峰面積值，經(jīng)方差分析，差異均極顯著，不同芋頭品種中沒食子酸和蘆丁的含量差異明顯。計(jì)算芋頭中沒食子酸和蘆丁的含量，結(jié)果見表2。芋頭中蘆丁的含量比沒食子酸高，每克鮮重葉片蘆丁的含量在12247.7～91189.6 ng/g之間。則每克鮮重葉片沒食子酸的含量在 529.4～1910.8 ng/g。

分析沒食子酸和蘆丁的含量與芋頭抗病性（病斑面積）的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)它們沒有相關(guān)性。說明沒食子酸和蘆丁含量高并不能提高芋頭的抗病性。

3? ? ?討論

芋頭是一種重要的作物。收集芋頭品種并確定其的疫霉菌的抗性對該病的防治具有一定的意義。芋頭抗疫霉菌的品種較少，本文所篩選的抗病品種將為提高芋頭的抗病性提供抗病材料。酚類物質(zhì)廣泛存在于植物中并且具有多種重要的功能，特別是在抗病方面具有重要的作用[3]。在橡樹有人認(rèn)為4種酚類物質(zhì)可作為由疫霉菌引起的橡樹抗猝死病抗性的生化指標(biāo)[7]。在芋頭中總的可溶性酚類物質(zhì)的含量與芋頭的抗病性相關(guān)[4]。然而植物酚類化合物是由多種物質(zhì)組成的，主要由類黃酮、酚酸和單寧等3類物質(zhì)構(gòu)成。確定它們的組成成份，并確定它們在抗病中作用，將有助于理解植物的抗病機(jī)理。目前有關(guān)芋頭酚類物質(zhì)的種類及其作用還未見報道。高效液相色譜是檢測酚類物質(zhì)的有效方法。有人用液相色譜分析了水稻莖桿和谷殼中酚類物質(zhì)的種類，發(fā)現(xiàn)沒食子酸和蘆丁是其主要的2種酚類物質(zhì)[8]。本文用9種酚類物質(zhì)標(biāo)樣，用高效液相色譜法確定了抗性不同類型的芋頭品種中含有沒食子酸和蘆丁2種酚類物質(zhì)。

蘆丁作為一種黃酮類化合物，黃酮類化合物多數(shù)具有抗菌作用，對細(xì)菌具有廣泛的抑制活性，能夠保護(hù)植物免受病原微生物侵害[9]。在幾種旱生植物中，總酚和類黃酮的含量與抗真菌的活性存在很強(qiáng)的正相關(guān)性[10]。沒食子酸是酚酸的一種，目前已發(fā)現(xiàn)沒食子酸能有效地抑制真菌的繁殖[11]。本文研究發(fā)現(xiàn)芋頭中沒食子酸和蘆丁的含量與疫病的抗性沒有相關(guān)性，其原因可能是：酚類物質(zhì)是多種物質(zhì)的混合物，它們共同作用能抑制病原的生長，但單獨(dú)一種或幾種對病原物的生長影響不大;酚類物質(zhì)通常與糖或有機(jī)酸結(jié)合形成可溶的共軛物，或者與細(xì)胞壁結(jié)合形成木質(zhì)素。還有部分沒食子酸和蘆丁共價接合，沒能測定出來[3]。

參考文獻(xiàn)

[1] Irwin SV， Kaufusi P， Banks K， de la Pe?a R， Cho JJ. Molecular characterization of taro （Colocasia esculenta） using RAPD markers[J]. Euphytica， 1998， 99（3）：183-189.

[2] Brooks FE. Detached-leaf bioassay for evaluating taro resistance to Phytophthora colocasiae [J]. Plant Disease，2008，92（1）：126-131.

[3] Lattanzio V， Lattanzio VMT， Cardinali A. Role of phenolics in the resistance mechanisms of plants against fungal pathogens and insects. In： Phytochemistry： Advances in Research （M）. （Imperato， F.， Ed.）. Kerala， India： Research Signpost.2006，p23–67.

[4] Mo JJ， Liang JX， Liu CL， Lv SL， Huang H， Wu RF， Hu HQ. Correlative evidence for involvement of phenolics compounds and peroxidase in resistance against Phytophthora colocasiae leaf blight in Colocasia esculenta[J]. Journal of Horticultural Science & Biotechnology，2015，90（4）：433–438.

[5] De Ascensao AR， Dubery IA. Panama disease：cell-wall reinforcement in banana roots in response to elicitors from Fusarium oxysporum f. sp. cubense race four[J]. Phytopathology， 2000，90（10）：1173–1180.

[6] Singh D， Mace ES， Godwin ID， Mathur PN， Okpul T， Taylor M， Hunter D， Kambuou R， Ramanatha Rao V， Jackson G. Assessment and rationalization of genetic diversity of Papua New Guinea taro （Colocasia esculenta） using SSR DNA fingerprinting[J]. Genetic Resources and Crop Evolution， 2008，55（6）：811-822.

[7] Conrad AO， McPherson BA， Wood DL， Madden LV， Bonello P. Constitutive phenolic biomarkers identify na?ve Quercus agrifolia resistant to Phytophthora ramorum， the causal agent of sudden oak death[J]. Tree Physiology，2017，37（12）：1686-1696.

[8] Karimi E， Mehrabanjoubani P， Keshavarzian M， Oskoueian E， Jaafar HZ， Abdolzadeh A. Identification and quantification of phenolic and flavonoid components in straw and seed husk of some rice varieties （Oryza sativa L.） and their antioxidant properties[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，2014，94（11）： 2324-2330.

[9] Hu W， Pan X， Li F， Dong W. UPLC-QTOF-MS metabolomics analysis revealed the contributions of metabolites to the pathogenesis of Rhizoctonia solani strain AG-1-IA[J]. PLoS One， 2018，13（2）： e0192486.

[10] Mohamed MSM Saleh AM， Abdel-Farid IB，El-Naggar SA. Growth， hydrolases and ultrastructure of Fusarium oxysporum as affected by phenolic rich extracts from several xerophytic plants[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology，2017，141（9）：57-64.

[11] 王艷娜.鴨梨果實(shí)輪紋病寄主一病原菌互作機(jī)理[D].北京：中國林業(yè)科學(xué)研究院，2007.