安 明 薄彧坤 楊 丹 張慧敏 鄔國棟*

(1.包頭醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2.包頭醫(yī)學院2014級藥學本科，內(nèi)蒙古 包頭 014060)

哈敦嘎日迪-13丸是根據(jù)蒙醫(yī)藥理論基礎和臨床經(jīng)驗設計的處方，并結(jié)合現(xiàn)代制劑工藝制成的制劑,制劑批準文號：M14020127，又名：哈敦海魯木勒十三味丸。處方由主藥五靈脂、石菖蒲、訶子和草烏葉、木香，副藥，拳參、黑冰片、香青蘭以及白豆蔻、紅花、甘松、麥冬和牛膽粉這13味藥物組成，具有清肺熱、消粘、止痢作用，可用于治療胃腸痙攣、嘔吐、腹瀉、赤白痢疾等疾病。方中的木香主治行氣止痛、健脾消食，其主要成分為木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯, 本試驗參考中國藥典、內(nèi)蒙古蒙藥制劑規(guī)范中木香測定方法，建立高效液相色譜法同時測定木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯，可作為哈敦嘎日迪-13丸的質(zhì)量控制方法。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(Ultimate 3000系列)、SartoriusBSAS-CW電子天平、AS2060B超聲波清洗器、Thermo制純水儀、過濾裝置、AP系列無油隔膜真空泵。

1.2 試劑 色譜純試劑(甲醇、乙腈)；分析純試劑(無水乙醇、三乙胺、磷酸、乙酸乙酯、甲酸、三氯甲烷)；水為高純化水；三氯化鐵(天津市盛奧化學試劑有限公司)；薄層層析硅膠G(青島海洋化工有限公司)。

1.3 試藥 木香烴內(nèi)酯對照品(批號111524-201710，含量以99.5%計)去氫木香內(nèi)酯(批號111525-201711，含量以99.8%計)購自于中國食品藥品檢定研究院。

哈敦嘎日迪-13丸供試品3批(生產(chǎn)批號：710202、201801、201802)，由包頭市蒙醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院提供；實驗室自制模擬小樣一批。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，本實驗研究采用的色譜柱為SHIMADZU C18色譜柱(4.6mm×150mm，5μm)；流動相為甲醇-水(65：35)；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：225nm；進樣量10μL。從多批檢測數(shù)據(jù)可見，木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的理論塔板數(shù)在5000以上即可達到較好的分離效果，考慮到不同顏色的色譜柱具有不同的理論塔板數(shù)，故確定理論塔板數(shù)按木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯峰計算應不低于5000[1]。

2.2 對照品溶液的制備 取木香烴內(nèi)酯對照品0.02266g，置于50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成含木香烴內(nèi)酯0.4509 mg·mL-1的對照品溶液，見圖1。同樣，取去氫木香內(nèi)酯對照品0.03813g，置于50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成含去氫木香內(nèi)酯0.3805mg·mL-1的對照品溶液，見圖2。

2.3 供試品溶液的制備 取同一批號樣品(批號710202)6份，約3.82g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，放置過夜，稱定重量，超聲處理30min,放冷，再稱定重量，用25%的甲醇補足減少的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為樣品溶液，用微孔濾膜濾過，即得，見圖4。

2.4 模擬樣溶液的制備 分別稱取哈敦嘎日迪-13所需藥材，按照處方比例要求混合，磨成粉末，精密稱取約3.82g,置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，放置過夜，稱定重量，超聲處理30min,放冷，再稱定重量，用甲醇補足減少的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為樣品溶液，用微孔濾膜濾過，即得，見圖5。

2.5 陰性對照溶液的制備分別稱取除木香外的其它藥材，按照哈敦嘎日迪-13處方比例要求混合，研磨成粉，按照“2.3”項下供試品溶液的制備方法制備陰性對照品溶液，見圖6。

2.6 專屬性試驗 分別精密量取對照品溶液、對照藥材溶液、供試品溶液、模擬樣溶液和陰性對照品溶液各10μL,注入高效液相色譜儀，按照“2.1”項下色譜條件下，記錄色譜圖，結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，在本色譜條件下供試品溶液以及模擬樣溶液中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯與藥品中的其他成分分離度好，在相同保留時間內(nèi)都有對應的色譜峰，而在此保留時間內(nèi)陰性對照品溶液并沒有干擾，故可知本次試驗方法的專屬性良好。

2.7 線性關系考察 取482.2μm/mL木香烴內(nèi)酯及423.152μg·mL-1對照品溶液5mL加入到20mL容量瓶中，精密加入甲醇制成含107.4μg·mL-1木香烴內(nèi)酯及105.788μg·mL-1去氫木香內(nèi)酯的混合對照品溶液；分別精密吸取2μL、4μL、6μL、8μL，10μL、12μL、及6μL、8μL、10μL、12μL、14μL、16μL注入高效液相色譜儀中[2]。以峰面積對濃度進行回歸分析，木香烴內(nèi)酯的回歸方程：y=6.8165x+0.0487,r=0.99998；去氫木香內(nèi)酯的回歸方程：y=5.0662x-0.0805,r=0.99995；結(jié)果顯示：木香烴內(nèi)酯在0.2148μg·mL-1～1.20288μg·mL-1的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)相應峰面積呈良好的線性關系，去氫木香內(nèi)酯在0.634728μg·mL-1～1.692608μg·mL-1，標準曲線結(jié)果見圖7、圖8，數(shù)據(jù)見表1、表2。

表1 木香烴內(nèi)酯的標準曲線數(shù)據(jù)表

濃度C(μg·mL-1)0.21480.42960.64440.85921.07401.20288平均峰面積A6.862213.679320.522127.337534.038640.9882

由表中數(shù)據(jù)可知：木香烴內(nèi)酯在0.2148～1.202888μg·mL-1的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與相應的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系。

表2 去氫木香內(nèi)酯的標準曲線數(shù)據(jù)表

由表中數(shù)據(jù)可知：去氫木香內(nèi)酯在0.6347～1.6926μg·mL-1的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與相應的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系。

2.8 精密度試驗 取“2.2”項下的木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯對照品溶液10μL,按照“2.2.1.1”項下的色譜條件連續(xù)重復進樣6針，木香烴內(nèi)酯峰面積的平均值為124.4337，RSD為0.12%(n=6)，去氫木香內(nèi)酯峰面積的平均值為83.0762，RSD為0.41%(n=6)說明其精密度良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0h,2h,4h,8h,12h注入高效液相色譜儀10μL按照“2. 1”項下的色譜條件進行測定，數(shù)據(jù)見表3、表4。

表3 不同時間測定樣品中木香烴內(nèi)酯的峰面積積分值

表4 不同時間測定樣品中去氫木香內(nèi)酯的峰面積積分值

由表中數(shù)據(jù)可知，供試品溶液中的木香烴內(nèi)酯及去氫木香內(nèi)酯在12h之內(nèi)穩(wěn)定，穩(wěn)定性良好

2.10 重復性試驗 取同一批號樣品(批號710202)6份，約3.82g，精密稱定，按照“2.3供試品溶液的配制”項下的方法平行制備6份供試品溶液，并且按照“2.1”項下的色譜條件測定木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的峰面積。計算可得各份樣品中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量，結(jié)果表明，哈敦嘎日迪-13丸中木香烴內(nèi)酯及去氫木香內(nèi)酯的重復性較好,見表5、表6、圖9。

表5 木香烴內(nèi)酯重復性測定結(jié)果

表6 去氫木香內(nèi)酯重復性測定結(jié)果

2.11 加樣回收率試驗 精密稱定樣品(批號710202)9份，每份約1.91g，分為3組，分別置于9個具塞錐形瓶中，再分別在3組具塞錐形瓶中精密加入木香烴內(nèi)酯對照品溶液(濃度0.4509 mg·mL-1)2mL，4mL,6mL。(約相當于供試品含有量的50%，100%，150%)再加入去氫木香內(nèi)酯(濃度0.3805mg/mL)4mL，8mL，12mL，(約相當于供試品含有量的50%，100%，150%)再加入甲醇44mL，38mL，32mL。分別注入上述溶液各10μL到高效液相色譜儀中。結(jié)果見表7、表8。

表7 木香烴內(nèi)酯加樣回收率測定結(jié)果

表8 去氫木香內(nèi)酯加樣回收率測定結(jié)果

結(jié)果表明：本方法具有較好的加樣回收率。

2.12 提取效率試驗 以甲醇50mL作為提取溶劑進行超聲提取，為保證被測成分提取完全，試驗中考察了超聲提取10min，20min，30min,40min不同超聲提取時間對提取效率的影響，結(jié)果見表9、表10。

表9 木香烴內(nèi)酯提取試驗

表10 去氫木香內(nèi)酯提取試驗

由表中數(shù)據(jù)可見，超聲處理30min后，供試品中木香烴內(nèi)酯及去氫木香內(nèi)酯的含量趨于穩(wěn)定，故將提取效率時間定為30min。

3 樣品含量測定

取3批樣品(批號為：71020、802202、802202)每批2份，每份精密稱定約3.82g，另取1批模擬樣2份，每份精密稱定約3.82g，按照“2.3”項下的供試品溶液制備。分別精密量取對照品溶液與供試品溶液，注入高效液相色譜儀，按“2. 1”項下的色譜條件測定，以外標法計算樣品中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量，結(jié)果見表11、表12。

表11 樣品中木香烴內(nèi)酯含量測定結(jié)果

表12 樣品中去氫木香內(nèi)酯含量測定結(jié)果

續(xù)表12 樣品中去氫木香內(nèi)酯含量測定結(jié)果

4 討論

4.1 檢測波長的選擇 精密稱取木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯對照品適量，于紫外-可見分光光度計上，在190nm～600nm做光譜掃描[3]。結(jié)果顯示木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯在225nm處有最大吸收，并參照中國藥典 “木香”含量測定項下木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的測定方法，最終選擇225nm作為檢測波長。

4.2 流動相的選擇 本次實驗使用高效液相色譜法，在實驗過程，筆者參照《中國藥典》2015年版“木香”藥材中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的測定方法，流動相為甲醇-水(65：35)，發(fā)現(xiàn)該色譜條件下，分離度好，理論塔板數(shù)較高，并具有較適宜的保留時間，故作為檢測流動相。

4.3 提取溶劑的選擇 為了有效提取木香中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯，筆者通過參照中國藥典 “木香”項下木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯含量測定方法，最終選用甲醇作為提取溶劑。并參照內(nèi)蒙古蒙藥制劑規(guī)范，加入甲醇50mL提取較完全。

5 結(jié)論

哈敦嘎日迪-13丸是以五靈脂、草烏葉、訶子等13味蒙藥組成的蒙藥制劑。為了更好的控制本品的質(zhì)量，本研究采用高效液相色譜法，測定哈敦嘎日迪-13丸中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量，建立了以木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯含量為依據(jù)的質(zhì)量標準。并對含量測定指標進行方法學考察，結(jié)果表明，此方法簡便易行、專屬性強、分離度好、測定結(jié)果準確可靠、靈敏、重現(xiàn)性好[4]，可用于哈敦嘎日迪-13丸的質(zhì)量控制。