楊雅欣 徐仕娟 馮小翠 羅國(guó)勇 張敬杰

(1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院 貴州省苗醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2. 貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550002)

紫金龍為毛茛科烏頭屬植物深裂黃草烏(Aconitum vilmorinianum var. altifidum W. T. Wang)的根及根莖。收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2003版)。是苗族習(xí)用藥材，具有祛風(fēng)除濕，溫經(jīng)止痛的功效，用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等病癥[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，該屬植物中的化學(xué)成分包括生物堿、黃酮、甾體及糖苷類(lèi)等，其中有效成分及特征成分主要為二萜生物堿類(lèi)[2-4]。因二萜生物堿類(lèi)化合物廣泛的生物活性，一直是藥物學(xué)家尋找新藥的一個(gè)重要來(lái)源[5]。

目前，未見(jiàn)紫金龍總生物堿含量測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道。酸性染料比色法是測(cè)定中藥總生物堿含量的一種經(jīng)典方法[6-7]，本文擬通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，利用酸性染料比色法測(cè)定苗藥紫金龍中總生物堿的含量。旨在建立紫金龍?zhí)崛∥镏锌偵飰A含量測(cè)定的方法，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-500，上海元析儀器有限公司)，超聲波清洗器(SK8210HP，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)，恒溫水浴鍋(DRHH，上海雙捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，分析天平(AR2140，上海奧豪斯有限公司)。

1.2 試藥 烏頭堿對(duì)照品(302-27-2，貴州迪大科技有限責(zé)任公司，純度≥98%)；無(wú)水乙醇(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)，石油醚(分析純，天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司)，正丁醇(分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司)，氯仿(分析純，西隴化工股份有限公司)，甲醇，氫氧化鈉等均為分析純；溴甲酚綠(指示劑,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.3 藥材 藥材購(gòu)自貴陽(yáng)市萬(wàn)東橋中藥市場(chǎng)，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院孫慶文教授鑒定為毛茛科烏頭屬植物深裂黃草烏Aconitum vilmorinianum var. altifidum W. T. Wang的根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 試液溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取紫金龍藥材粉末(過(guò)60目篩)2.0g于25mL的圓底燒瓶中，按紫金龍最佳提取方案[8]，加入固液比1:8 的65%乙醇溶液16mL，85℃水浴回流提取2.5h，冷卻，過(guò)濾，70℃蒸干溶劑，浸膏加入75%乙醇15mL使之溶解，轉(zhuǎn)入分液漏斗中，分別用等體積的石油醚、氯仿、正丁醇依次萃取3次，合并萃取液，取氯仿萃取液所得浸膏用75%乙醇5mL溶解至完全，精密量取0.3mL于5ml容量瓶中，75%乙醇定容至刻度，即得供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取烏頭堿對(duì)照品5.0mg，甲醇定容至5mL，制得1.0mg/mL對(duì)照品貯備液，逐級(jí)稀釋?zhuān)玫?.1、0.15、0.2、0.25、0.3mg/mL的烏頭堿對(duì)照品溶液。

2.1.3 酸料染料的制備[9]0.05mol/L氫氧化鈉溶液的配制：精密稱(chēng)取氫氧化鈉0.2g于100mL錐形瓶中，加入蒸餾水使之溶解并稀釋至刻度，即得。

溴甲酚綠緩沖液的配制：精密稱(chēng)取溴甲酚綠0.1g，加入0.05mol/L氫氧化鈉2.8mL使之溶解，再加水稀釋至200mL，即得。

2.2 測(cè)定條件的選擇

2.2.1 酸性染料的顯色方法 精密吸取烏頭堿對(duì)照品或供試品溶液1.2mL置60mL的分液漏斗中，分別加入溴甲酚綠溶液24mL和氯仿12mL，密塞劇烈振搖20min，靜置分層10min，取氯仿層進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)。

2.2.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 以2.1.1，2.1.2的方法分別制備供試品及對(duì)照品溶液，并按照2.2.1的顯色方法顯色，在190～800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，考察吸收波長(zhǎng)。結(jié)果表明，供試品在410～420nm處有最大吸收，烏頭堿對(duì)照品在410～415nm處有最大吸收峰，綜合考慮，最終選擇415nm作為實(shí)驗(yàn)檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 酸性染料比色法的方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 精密稱(chēng)取烏頭堿對(duì)照品5.0mg，甲醇定容至5mL，制得1.0mg/mL對(duì)照品貯備液，逐級(jí)稀釋?zhuān)玫?.1、0.15、0.2、0.25、0.3mg/mL的烏頭堿對(duì)照品溶液。分別精密吸取1.2mL置60mL的分液漏斗中，加入溴甲酚綠溶液24mL和氯仿12mL，密塞劇烈振搖20min，靜置分層10min，取氯仿層于415nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制曲線(xiàn)，得回歸方程為Y=2.76X+0.0386(r=0.999，n=5)。結(jié)果表明，烏頭堿的濃度在0.1mg/mL-0.3mg/mL范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取濃度為0.2mg/mL的烏頭堿對(duì)照品置于分液漏斗中，按“2.2.1”項(xiàng)下的操作方法，取氯仿層于415nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，測(cè)得RSD = 0.74%，說(shuō)明儀器所測(cè)得數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

2.3.3 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批紫金龍藥材細(xì)粉6份，每份2.0g，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液6份，每份1.2mL，依“2.2.1”項(xiàng)下方法處理顯色后，于415nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，結(jié)果紫金龍中總生物堿平均含量為7.82mg/g，RSD = 1.43%，表明實(shí)驗(yàn)方法重現(xiàn)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液1.2mL，依“2.2.1”項(xiàng)下方法處理顯色后，分別在0,20,40,60，80,100min于415nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，結(jié)果RSD = 0.80%，表明供試品溶液在100min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的紫金龍藥材粉末6份，分別加入等量烏頭堿對(duì)照品，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依“2.2.1”項(xiàng)下方法處理顯色后，于415nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 紫金龍總生物堿加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.3 樣品的含量測(cè)定 取4個(gè)批次的紫金龍?zhí)崛∥?，每個(gè)批次平行測(cè)定3次，每次精密量取1.2mL，依“2.2.1”項(xiàng)下進(jìn)行酸性染料比色，取氯仿層于415nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算紫金龍總生物堿的含量，得出紫金龍中總生物堿平均含量為7.27mg/g。

表2 紫金龍?zhí)崛∥镏锌偵飰A含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

酸性染料比色法是生物堿類(lèi)化合物與氫離子生產(chǎn)陽(yáng)離子，酸性染料比色與其定量結(jié)合成有色絡(luò)合物，被有機(jī)溶劑提取，在一定波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，即可計(jì)算總生物堿的含量[6]。酸性染料比色法所測(cè)定的結(jié)果較準(zhǔn)確，應(yīng)用較多。

本實(shí)驗(yàn)采用酸性染料比色法，通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)對(duì)苗藥紫金龍藥材總生物堿進(jìn)行定量分析，建立其中總生物堿含量測(cè)定的方案。測(cè)得紫金龍?zhí)崛∥镏锌偵飰A的含量平均為7.27 mg/g。該方法具有一定的專(zhuān)屬性和準(zhǔn)確度，靈敏度高，簡(jiǎn)便易行，適宜紫金龍藥材中總生物堿含量測(cè)定。