劉騰飛，楊代鳳*，章雪明，范 君，梁鳳玲，錢 輝

(1.江蘇太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 蘇州 215155；2.蘇州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測中心，江蘇 蘇州 215128)

多氯聯(lián)苯(Polychlorinated biphenyls,PCBs)是一類人工合成的氯代聯(lián)苯類芳烴化合物，曾作為優(yōu)質(zhì)工業(yè)添加劑(熱載體、阻燃劑、增塑劑、絕緣材料等)大量應(yīng)用于印刷、化工、電力、塑料、油漆等領(lǐng)域[1]。大量的研究已證明，PCBs具有很強(qiáng)的生物毒性，能夠?qū)е律矬w內(nèi)分泌紊亂、免疫和生殖系統(tǒng)破壞，誘發(fā)癌癥和神經(jīng)性疾病[2-3]，20世紀(jì)70年代開始已在全球范圍內(nèi)停止使用，但由于其高穩(wěn)定、半揮發(fā)等特性，使之在空氣[4]、土壤[5]、水體[6]、沉積物[7]、農(nóng)產(chǎn)品[8]、水產(chǎn)品[9]等多種介質(zhì)中被廣泛檢出，已成為一類普遍存在的持久性有機(jī)污染物，被列入斯德哥爾摩公約首批控制污染物名單[10]。鑒于PCBs的生物毒性和環(huán)境風(fēng)險，研究并建立快速、準(zhǔn)確、靈敏、高效的PCBs分析方法尤為重要。

目前，PCBs的檢測方法主要有氣相色譜法(GC/ECD)[5]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[4,7-8]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[6,9]等。其中，GC/ECD法操作簡單、快速，但定性能力不足；GC-MS/MS法快速、靈敏、定性可靠，但儀器昂貴且操作要求較高，應(yīng)用不廣泛；GC-MS法不僅定性定量準(zhǔn)確，而且儀器價格相對低廉，是目前測定PCBs最常用的方法，也是國家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)推薦方法[11-12]。由于PCBs的殘留濃度低，且樣品基質(zhì)中干擾物較多，因此需對樣品進(jìn)行分離富集和凈化。分散固相萃取是近年來快速發(fā)展的一種高效前處理技術(shù)，具有操作簡單、快速、靈活、成本低等優(yōu)點(diǎn)[13]，已被廣泛用于環(huán)境、食品等檢測領(lǐng)域。吸附劑是影響該技術(shù)萃取效果的關(guān)鍵因素，常見的吸附劑填料，如N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳黑(GCB)、C18等對復(fù)雜基質(zhì)的凈化效果不理想，而且價格相對較高。多壁碳納米管(MWCNTs)是一種具有較強(qiáng)吸附性能的納米碳材料，其與PSA、C18、GCB相比具有更大的比表面積，因此吸附能力更強(qiáng)，且價格相對低廉，同時具有特殊的π-π共軛作用，選擇性較高，是一種理想的分散固相萃取吸附劑，已成功應(yīng)用于水體、土壤、食品及農(nóng)產(chǎn)品等基體中農(nóng)藥[14]、獸藥[15]、重金屬[16]、微生物及毒素[17-18]、食品非法添加物[19]等污染物的分離與檢測。然而，將MWCNTs作為分散固相萃取吸附劑用于茶青中PCBs的檢測尚未見報道。

作為加工各類成品茶的原料，茶青的安全性直接影響茶葉的食用安全以及茶產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。目前，有關(guān)茶青中有害物質(zhì)的檢測已有相關(guān)報道，但主要集中在農(nóng)藥殘留[20]、重金屬[21]等方面，對茶青中PCBs的檢測研究尚屬空白。本實(shí)驗(yàn)選取蘇州特色茶種碧螺春茶青為研究對象，采用吸附性能好、凈化效率高的羧基化多壁碳納米管(MWCNTs-COOH)作為主要分散固相萃取吸附劑，建立了同時分析茶青中18種PCBs的GC-MS方法，以期為茶葉生長過程中PCBs的過程監(jiān)測和源頭監(jiān)督檢驗(yàn)提供技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

7890B-5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；KQ-500DE超聲波清洗器(昆山超聲儀器公司)；TG16-WS臺式高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器公司)；K600粉碎機(jī)(德國博朗公司)；HSC-24B氮吹儀(天津恒奧科技公司)；Direct-Q5UV型超純水機(jī)(美國Millipore公司)。

1.2 藥品與試劑

18種PCBs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB153、PCB138、PCB180、PCB81、PCB77、PCB123、PCB114、PCB105、PCB126、PCB167、PCB156、PCB157、PCB169、PCB189(質(zhì)量濃度為10mg/L，美國o2si公司)。

多壁碳納米管(MWCNTs，長度10～30μm，外徑10～20nm，內(nèi)徑5～10nm，純度>95%，比表面積>200m2/g)、羥基化多壁碳納米管(MWCNTs-OH，長度10～30μm，外徑10～20nm，內(nèi)徑5～10nm，純度>95%，比表面積>200m2/g)、MWCNTs-COOH(長度10～30μm，外徑10～20nm，內(nèi)徑5～10nm，純度>95%，比表面積>200m2/g)、N-丙基乙二胺(PSA，粒度40～60μm)、石墨化碳黑(GCB，粒度40～120μm)、十八烷基鍵合硅膠(C18，粒度40～60μm)均購于南京先豐納米材料科技有限公司；弗羅里硅土(Florisil，60～100目，農(nóng)殘級，美國ROE公司)；正己烷(色譜純，瑞典歐普森公司)；丙酮、乙酸乙酯、乙腈、甲苯、無水硫酸鈉(用前于450℃下灼燒4h)、無水硫酸鎂(使用前于620℃下灼燒4h)均為分析純，購于上海國藥集團(tuán)公司。

碧螺春茶青樣品采自蘇州洞庭碧螺春茶園，采集一芽二、三葉茶青，粉碎后于-20℃下保存，備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確量取1 mL 10 mg/L的18種PCBs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，用正己烷定容，配成1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)母液，于4 ℃冰箱冷藏保存；使用前，取出放至室溫后，用正己烷逐級稀釋成5、10、50、100、500 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

取1 g空白茶青樣品，按照優(yōu)化提取凈化條件處理后，上機(jī)樣液用氮?dú)獯蹈?，加?.0 mL不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，振蕩混勻，過0.22 μm有機(jī)濾膜，得到對應(yīng)濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2樣品前處理稱取粉碎后的茶青樣品1 g(精確至0.01 g)于50 mL塑料離心管中，加入1 g無水硫酸鈉和15 mL正己烷-丙酮(1∶1,體積比)，渦旋混勻，在500 W功率下超聲提取15 min，期間取出振搖2次，8 000 r/min離心4 min，取7.5 mL上清液至玻璃試管中，氮吹濃縮至0.5 mL，加入1 mL甲苯，氮吹至0.5 mL后，用甲苯定容至5 mL，待凈化。

將上述5 mL甲苯溶液轉(zhuǎn)移至填裝0.09 g MWCNTs-COOH、0.05 g PSA和0.1 g無水硫酸鎂的凈化管中，渦旋2 min，以9 000 r/min離心5 min，取上清液氮吹近干，加入0.5 mL正己烷，渦旋混勻，過0.22 μm有機(jī)膜，供GC-MS分析。

1.3.3儀器條件色譜條件：HP-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣為高純氮?dú)?；恒流模式，流?.2 mL/min；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量1.0 μL。升溫程序：初始溫度80 ℃，保持2 min；以20 ℃/min升溫至180 ℃，保持2 min；以3 ℃/min升溫至230 ℃，保持2 min；再以10 ℃/min升溫至280 ℃，保持2 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊(EI)離子源，電離電壓70 eV，離子源溫度280 ℃，四極桿溫度150 ℃，傳輸線溫度280 ℃，檢測方式：選擇離子掃描(SIM)，溶劑延遲5 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測條件的優(yōu)化

PCBs屬弱極性化合物，因此實(shí)驗(yàn)選用弱極性、低流失的HP-5MS毛細(xì)管柱進(jìn)行色譜分離，并根據(jù)靈敏度和分析時間，通過調(diào)整色譜升溫程序、載氣流速、進(jìn)樣口溫度等參數(shù)，最終確定“1.3.3”的色譜條件。

在選定的色譜條件下，利用GC-MS全掃描方式，在m/z50～450范圍內(nèi)對500 μg/L的PCBs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，得到總離子流色譜圖(TIC)，根據(jù)TIC圖通過NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索，確定各目標(biāo)物的保留時間，并在扣除背景后的質(zhì)譜圖中，選擇豐度高、m/z大且基質(zhì)干擾少的特征離子，分時段分別監(jiān)測。18種PCBs的保留時間、特征離子及其豐度比見表1。最優(yōu)條件下的GC-MS色譜圖見圖1。

表1 18種PCBs的分子式、保留時間、特征離子及其相對豐度Table 1 Formulas,retention times,characteristic ions and relative abundances of 18 PCBs

(續(xù)表1)

No.AnalyteFormulaRetention time(min)Time window (min)Monitoring ions(m/z) and relative abundances(%)9PCB153(2,2',4,4',5,5'-六氯聯(lián)苯)C12H4Cl621.32360*(100),290(64.8),145(24.4)10PCB105(2,3,3',4,4'-五氯聯(lián)苯)C12H5Cl521.46326*(100),254(35.7),127(13.5)11PCB138(2,2',3,4,4',5'-六氯聯(lián)苯)C12H4Cl622.6822.00～24.00360*(100),290(62.2),145(20.2)12PCB126(3,3',4,4',5-五氯聯(lián)苯)C12H5Cl523.13326*(100),254(30.4),127(12.9)13PCB167(2,3',4,4',5,5'-六氯聯(lián)苯)C12H4Cl624.1724.00～25.00360*(100),290(37.8),145(15.5)14PCB156(2,3,3',4,4',5-六氯聯(lián)苯)C12H4Cl625.3225.00～26.00360*(100),290(34.2),145(14.7)15PCB157(2,3,3',4,4',5'-六氯聯(lián)苯)C12H4Cl625.62360*(100),290(45.3),145(17.3)16PCB180(2,2',3,4,4',5,5'-七氯聯(lián)苯)C12H3Cl726.2526.00～27.00394*(100),324(72.1),162(35.6)17PCB169(3,3',4,4',5,5'-六氯聯(lián)苯)C12H4Cl627.4727.00～29.00360*(100),290(40.3),145(16.5)18PCB189(2,3,3',4,4',5,5'-七氯聯(lián)苯)C12H3Cl729.4229.00～30.00394*(100),324(50.3),162(22.8)

* quantitative ion

圖 1 18種PCBs標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/L)的選擇離子色譜圖Fig.1 SIM chromatogram of 18 PCBs(10 μg/L) standard solution the number denoted was the same as that in Table 1

圖2 不同提取溶劑對茶青中18種PCBs加標(biāo)回收率的影響Fig.2 Effects of different extraction solvents on recoveries of 18 PCBs spiked in fresh tea leaves different lowercase letters denote significant differences at p-value <0.05 among groups using one-way analysis of variance tests

2.2 提取條件的選擇

2.2.1提取溶劑的選擇以碧螺春茶青為基質(zhì)，在10 μg/kg加標(biāo)水平下，分別采用正己烷、乙腈、乙酸乙酯、正己烷-丙酮(1∶1)、正己烷-乙酸乙酯(4∶1)作為提取溶劑，比較了18種目標(biāo)物的提取效率(圖2)。結(jié)果表明，以正己烷、乙腈或正己烷-乙酸乙酯(4∶1)為提取溶劑時，回收率為37%～76%，且大多數(shù)目標(biāo)物的回收率小于60%；用乙酸乙酯提取時，除PCB138的回收率大于80%外，其余目標(biāo)物均在56%～75%之間，而以正己烷-丙酮(1∶1)為提取溶劑時，目標(biāo)物的整體提取效率最好，回收率為81%～95%，因此實(shí)驗(yàn)選擇正己烷-丙酮(1∶1)作為最佳提取溶劑。在此基礎(chǔ)上，考察了提取溶劑體積(5、8、10、12、15 mL)對目標(biāo)物回收率的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)提取溶劑體積為5 mL時，18 種目標(biāo)物的提取效率較低，回收率大多在70%左右，隨著提取溶劑體積的增大，目標(biāo)物的提取效率增加，當(dāng)提取溶劑體積為15 mL時提取效率最佳，回收率為86%～104%，因此選擇15 mL為最佳提取溶劑體積。

2.2.2提取方式的選擇超聲提取法具有條件溫和、速度快、批處理能力強(qiáng)的特點(diǎn)，其獨(dú)特的空化作用和機(jī)械振動作用可達(dá)到強(qiáng)化提取、提高效率的效果，因此實(shí)驗(yàn)采用超聲提取法進(jìn)行前處理，并以加標(biāo)水平10 μg/kg的碧螺春茶青為基質(zhì)，考察了不同超聲提取時間(5、10、15、20 min)對目標(biāo)物回收率的影響。結(jié)果表明，當(dāng)超聲提取時間為5 min時，18種目標(biāo)物的回收率為54%～72%，回收率隨著超聲提取時間的增加而增大，超聲提取15 min和20 min時回收率分別為94%～116%和92%～117%。綜合考慮回收率和分析時間，實(shí)驗(yàn)選擇超聲提取時間為15 min。

2.3 凈化條件的選擇

2.3.1吸附劑種類與用量的選擇實(shí)驗(yàn)考察了Florisil、C18、PSA、GCB、MWCNTs、MWCNTs-OH、MWCNTs-COOH 7種凈化吸附劑對茶青提取液中色素的去除效果。結(jié)果顯示，茶青經(jīng)提取后，溶液呈淺綠色渾濁狀；分別經(jīng)Florisil、C18、PSA吸附劑凈化后，溶液顏色變化不大；經(jīng)GCB 吸附劑凈化后呈黃綠色；碳納米管對色素具有良好的吸附去除作用，提取液經(jīng)3種碳納米管凈化后趨于無色，其中MWCNTs-COOH對色素的凈化效果最好，凈化后溶液無色透明。PSA對色素的去除能力較弱，但能有效去除茶多酚和兒茶素類物質(zhì)[22]。因此，本實(shí)驗(yàn)將MWCNTs-COOH和PSA混合使用對茶青提取液進(jìn)行凈化，以有效除去提取液中的色素、茶多酚、兒茶素等雜質(zhì)成分。

吸附劑用量是影響樣品凈化效果和目標(biāo)物回收率的重要因素，用量小則凈化效果不明顯，用量大則回收率偏低，不能滿足分析要求。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在加標(biāo)水平10 μg/kg的茶青提取液中，當(dāng)加入MWCNTs-COOH凈化處理后，僅PCB52、PCB101、PCB153、PCB138、PCB180 的回收率大于82%，其余13種目標(biāo)物的回收率較差，均低于64%，其中PCB81、PCB77、PCB126、PCB169 4種目標(biāo)物的回收率為0，說明MWCNTs-COOH在去除色素的同時，對部分PCB產(chǎn)生了強(qiáng)烈吸附，從而導(dǎo)致回收率偏低。實(shí)驗(yàn)在提取后濃縮過程中，以甲苯對提取劑正己烷-丙酮(1∶1)進(jìn)行溶劑置換后再凈化，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物的回收率由0%～85%增至97%～104%。進(jìn)一步考察了甲苯用量(2、3、4、5、6 mL)對目標(biāo)物凈化回收率的影響。結(jié)果顯示，隨著甲苯用量的增加，目標(biāo)物的回收率呈增大趨勢，當(dāng)其用量為5 mL時回收率為90%～110%，繼續(xù)增大甲苯用量至6 mL時，部分目標(biāo)物(PCB153、PCB167、PCB156、PCB157)的回收率大于115%，可能是由于雜質(zhì)被溶解而引起基質(zhì)效應(yīng)所致。因此，選擇甲苯的最佳用量為5 mL。

以加標(biāo)水平10 μg/kg的碧螺春茶青為基質(zhì)，按“1.3.2”方法進(jìn)行前處理，比較了不同MWCNTs-COOH用量(0.07、0.08、0.09、0.10、0.11 g)對目標(biāo)物回收率的影響。結(jié)果顯示，MWCNTs-COOH對提取液色素的凈化效果顯著，隨著其用量的增大，提取液顏色逐漸變淺，目標(biāo)物回收率呈下降趨勢，當(dāng)用量為0.09 g時，提取液顏色趨于澄清透明，且所有目標(biāo)物的回收率均在95%～102%之間。因此，選擇MWCNTs-COOH的最佳用量為0.09 g。

繼續(xù)考察了PSA用量(0.05、0.06、0.07、0.08、0.09 g)對茶青提取液的凈化效果。結(jié)果表明，茶青提取液經(jīng)不同質(zhì)量的PSA凈化后，溶液顏色仍較深且變化不大，且隨著PSA用量的增加，大部分目標(biāo)物的回收率逐漸降低；當(dāng)PSA用量為0.05 g時，所有目標(biāo)物的回收率均在92%～101%之間，因此選擇PSA的最佳用量為0.05 g。

2.3.2吸附凈化時間的選擇吸附凈化時間會對目標(biāo)物的回收率和凈化效果產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)以加標(biāo)水平10 μg/kg的碧螺春茶青為基質(zhì)，按“1.3.2”方法，將渦旋振蕩時間分別設(shè)為1、2、3、4 min，考察了吸附凈化時間對目標(biāo)物回收率的影響。結(jié)果表明，當(dāng)凈化時間為2 min時，目標(biāo)物的整體回收率較好，為97%～109%。繼續(xù)延長凈化時間，部分目標(biāo)物易被吸附劑吸附，導(dǎo)致回收率下降。因此，實(shí)驗(yàn)選擇最佳吸附凈化時間為2 min。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)普遍存在于痕量物質(zhì)的分析中，可增強(qiáng)或減弱目標(biāo)物的信號，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。本實(shí)驗(yàn)以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值評價基質(zhì)效應(yīng)，當(dāng)比值為0.9～1.1時，說明基質(zhì)效應(yīng)不明顯，可以忽略；當(dāng)比值大于1.1或小于0.9時，表明存在基質(zhì)增強(qiáng)或減弱效應(yīng)[23]。由表2可知，PCB28和PCB52在茶青基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)不明顯，其余目標(biāo)物在茶青基質(zhì)中均存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值為1.105～1.130。因此，本方法在實(shí)際樣品的檢測中均采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.5 線性范圍、檢出限及定量下限

按照“1.3.1”分別配制5、10、50、100、500 μg/kg的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按“1.3.3”分析條件進(jìn)樣測定，以各目標(biāo)物的峰面積(y)為縱坐標(biāo)，含量(x，μg/kg)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，線性方程及相關(guān)系數(shù)(r)如表2所示。結(jié)果表明，在5～500 μg/kg范圍內(nèi)，18 種目標(biāo)物的峰面積與其含量呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 8～1.000 0。在空白基質(zhì)中添加不同含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行樣品前處理和測定，以特征離子色譜峰的信噪比(S/N)≥3確定方法的檢出限(LOD)為0.5～1.4 μg/kg，以S/N≥10且回收率滿足要求的最小加標(biāo)濃度為定量下限(LOQ)，各目標(biāo)物的LOQ均為5 μg/kg(表2)。

表2 18種PCBs的線性范圍、基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限(LODs)、定量下限(LOQs)及基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Linear ranges,matrix standard curves,correlation coefficients(r),LODs，LOQs and matrix effects of 18 PCBs

*slope ratio=the calibration curve slopes of matrix-matched standards/the calibration curve slopes of solvent standards

2.6 回收率與精密度

在空白茶青基質(zhì)中，分別添加5、10、100 μg/kg的18種PCBs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻后靜置得到加標(biāo)樣品，按照“1.3.2”和“1.3.3”進(jìn)行前處理和測定，每個濃度水平重復(fù)6次，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表3。在3個加標(biāo)水平下，18種PCB的平均回收率為92.3%～111%，RSD為1.2%～7.9%，方法的準(zhǔn)確度高、精密度好。

表3 18種PCBs在茶青中的平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Average recoveries and relative standard deviations (RSD) of 18 PCBs in spiked fresh tea leaves(n=6)

圖 3 茶青樣品添加18種PCBs的選擇離子色譜圖Fig.3 SIM chromatogram of 18 PCBs spiked in fresh tea leaves the number denoted was the same as that in Table 1

2.7 方法的應(yīng)用

將建立的方法應(yīng)用于蘇州洞庭東山和西山、常熟虞山等茶青樣品中18種PCBs的檢測，在所有樣品中均未檢出PCBs。圖3為加標(biāo)樣品的選擇離子色譜圖，可以看出，本方法能很好地應(yīng)用于茶青中18種PCBs的檢測。

3 結(jié) 論

本文建立了茶青中18種PCBs的分散固相萃取凈化及GC-MS檢測方法。茶青樣品經(jīng)正己烷-丙酮(1∶1)混合溶液提取，甲苯溶劑置換后，以MWCNTs-COOH和PSA混合吸附劑凈化，有效地減少了基質(zhì)中色素等雜質(zhì)干擾，可獲得較好的提取效率和凈化效果,18種目標(biāo)物的LOD為0.5～1.4 μg/kg，LOQ均為5 μg/kg。該方法操作簡單，凈化效果好，準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性好，為開展茶青中PCBs的檢測研究提供了有效方法，對于保證茶葉質(zhì)量安全具有積極的意義。