楊 輝，賈紅兵，李 江，周誠(chéng)君，王 靖

（中日友好醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京 100029）

分枝桿菌已報(bào)道150余種[1]，除了麻風(fēng)分枝桿菌 （mycobacterium，leprae）和結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）） ，其余統(tǒng)稱為非結(jié)核分枝桿菌 （non-tuberculous mycobacterium，NTM）。NTM肺病與結(jié)核病有著類似的臨床表現(xiàn)，常被誤診為肺結(jié)核。近年來(lái)，NTM的分離率和發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[2]。以分枝桿菌培養(yǎng)及抗酸染色鏡檢為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)方法不能有效區(qū)分MTB與NTM。另外，諾卡菌屬易與NTM混淆[3]。

DNA測(cè)序是核酸診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，隨著成本降低，測(cè)序?qū)⒊蔀槲⑸锖怂釞z測(cè)的常規(guī)選項(xiàng)。16S rDNA是是細(xì)菌分類研究中最常用的靶序列。分枝桿菌rpoB基因編碼RNA聚合酶β亞基，與hsp65（heat shock protein 65）基因一起作為靶基因在分枝桿菌型屬鑒定中得到廣泛應(yīng)用[4，5]。本研究旨在利用核酸檢測(cè)技術(shù)，篩查綜合性醫(yī)院臨床分離的分枝桿菌并鑒別菌種。使用16S rDNA基因來(lái)篩查分枝桿菌，我們使用rpoB基因來(lái)鑒定分枝桿菌菌種，以hsp65基因進(jìn)行復(fù)核。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源

2015年10月～2016年9月，我院需診斷或除外肺結(jié)核的患者留取痰樣本4467份，排除重復(fù)檢測(cè)，關(guān)聯(lián)至就診者2236例，其中抗酸陽(yáng)性者40例。經(jīng)改良L-J培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)2～8周，菌落涂片經(jīng)萋-尼氏染色，鏡檢陽(yáng)性的菌落經(jīng)16SrDNA測(cè)序排除諾卡菌及其他非目的菌，獲得32例分枝桿菌臨床分離株。

1.1.2 主要試劑和儀器

改良羅氏培養(yǎng)基購(gòu)自濟(jì)南賽爾生物公司；Blend Taq plus DNA聚合酶購(gòu)自日本Toyobo公司；瓊脂糖購(gòu)自西班牙Biowest公司；溴化乙錠購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；ABI 9700 PCR儀購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物信息公司；Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA樣本制備

參考萬(wàn)康林團(tuán)隊(duì)的研究文獻(xiàn)[6]，在生物安全柜中用接種環(huán)刮取細(xì)菌，置于100μl的TE液中混勻，金屬浴 80℃滅活 60min，100℃加熱 30min，立即置于冰上2min，12000r/min離心3min，移上清置-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA擴(kuò)增及測(cè)序

參考前人的研究方法[3，6，7]，比較核酸診斷分枝桿菌的種屬特異性保守序列，選擇16S rDNA、hsp65基因和rpoB基因作為本研究的靶序列，PCR引物由上海生工公司合成（見(jiàn)表1）。PCR反應(yīng)體系為 30μl，取 10×含鎂的緩沖液 3μl，2.5 mmol/L 的 dNTPs （dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP）3μl，10μmol/L 引物各 3μl，模板 DNA 3μl，Blend Taq plus DNA聚合酶1U，最后加滅菌水至終體系30 μl。PCR 循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性 5min，94℃變性30s，60℃ 延伸1min，共反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，最后72℃ 延伸 5min。擴(kuò)增后取5μl PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳后用溴化乙錠（EB）染色10min，并在凝膠成像系統(tǒng)上觀察分析。

1.2.3 PCR產(chǎn)物測(cè)序分析

PCR產(chǎn)物由北京睿博生物公司進(jìn)行測(cè)序。16S rDNA、hsp65基因和rpoB基因3個(gè)靶序列信息上傳 NCBI 網(wǎng)站（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），進(jìn)行同源性比較分析。序列同源性＞97%者即可確定菌型。

2 結(jié)果

2.1 菌株篩選

2015年10月～2016年9月，中日友好醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室L-J培養(yǎng)基分離菌落149株，萋-尼氏抗酸陽(yáng)性者經(jīng)16S rDNA測(cè)序確認(rèn)為分枝桿菌32株，均分離自不同的臨床患者痰樣。

表1 引物序列

圖1 rpoB與hsp65 PCR產(chǎn)物測(cè)序前電泳

2.2 分枝桿菌分型

32株分枝桿菌核酸擴(kuò)增完成后，產(chǎn)物電泳確認(rèn)（見(jiàn)圖1），經(jīng)rpoB基因序列分析，包括結(jié)核分枝桿菌22株，分離率為68.8%，非結(jié)核分枝桿菌10株，分離率為31.2%。10株NTM菌株中，包括膿腫分枝桿菌4株，胞內(nèi)分枝桿菌3株，海分枝桿菌1株，龜分枝桿菌1株，產(chǎn)黏液分枝桿菌1株。hsp65基因測(cè)序結(jié)果與rpoB基因測(cè)序結(jié)果完全一致。

3 討論

肺結(jié)核初診初查大多是由綜合性醫(yī)院完成，但是因?yàn)樯锇踩蚪Y(jié)核專力量不強(qiáng)等原因，綜合性醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室分枝桿菌鑒定分型方法未能普遍開(kāi)展，導(dǎo)致綜合性醫(yī)院分枝桿菌研究相對(duì)稀缺。如果預(yù)先對(duì)樣本進(jìn)行菌體滅活，然后提取核酸可以減少生物危害，所以應(yīng)用相對(duì)安全的核酸診斷技術(shù)，可成為綜合型醫(yī)院今后結(jié)核病篩查、診療工作的重點(diǎn)之一。

本研究使用了rpoB基因與hsp65基因進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定，結(jié)果完全一致，但hsp65基因擴(kuò)增效率較低，其中5株菌進(jìn)行了二次PCR擴(kuò)增。其原因可能與我們的核酸樣本制備的方法有關(guān)?？紤]到濕熱容易使分枝桿菌滅活，操作須在安全柜內(nèi)操作，所以我們使用了最簡(jiǎn)易的生物安全柜內(nèi)熱裂解法。這樣制備的DNA比較破碎，hsp65基因PCR產(chǎn)物片段大，完整的核酸模板數(shù)量少，擴(kuò)增效率低于rpoB基因。

本研究分支桿菌的NTM分離率為31.2%，遠(yuǎn)高于國(guó)內(nèi)同時(shí)期結(jié)核病?？漆t(yī)院的研究數(shù)據(jù)，福州肺科醫(yī)院 NTM 分離率為 10.2%（649/6362）[6]，上海肺科醫(yī)院NTM分離率為 10.8%（95/877）[7]，新疆自治區(qū)胸科醫(yī)院NTM分離率為4.98%（183/3674）[8]，沈陽(yáng)市胸科醫(yī)院NTM分離率為1.87%（72/3847）[9]，重慶公衛(wèi)醫(yī)療救治中心NTM分離率為10.23%（58/567）[10]。數(shù)據(jù)的差異與分支桿菌的地理分布和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段有關(guān)[11，12]，但現(xiàn)行的結(jié)核病防治模式也會(huì)對(duì)之產(chǎn)生影響。因此在綜合醫(yī)院提高分枝桿菌檢測(cè)水平，是規(guī)范結(jié)核病診療的重要環(huán)節(jié)。