付銀鋒 康文娣

1河南省中醫(yī)院健康體檢中心（鄭州 450002）；2河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科（鄭州 450000）

皮膚惡性黑素瘤（cutaneous malignant melano?ma，CMM）是一種起源于黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤，具有易轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)移早、侵襲性強(qiáng)、病死率高等特點(diǎn)。目前，CMM的臨床治療手段有限，治療極具難度［1-2］。因此，尋找一種安全性高、療效好、副作用小的抗黑素瘤藥物迫在眉睫［3］。木犀草素是一種天然的四羥基黃酮化合物，廣泛存在于多種蔬菜和藥用植物中，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抑制血管生成等多種藥理活性［4-6］。目前研究表明，木犀草素在結(jié)腸癌［7］、乳腺癌［8］、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［9］等多種腫瘤中發(fā)揮重要的抑癌作用，包括抑制癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡等。但木犀草素在CMM中的作用還不清楚。黑色素瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡及血管內(nèi)皮生長因子（endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)與CMM的發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)。因此，本研究通過探討木犀草素對黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375和B16F10的增殖、侵襲、凋亡及VEGF表達(dá)的作用及其分子調(diào)控機(jī)制，從而確定木犀草素在CMM發(fā)展中的作用，為木犀草素治療CMM提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理A375和B16F10細(xì)胞（美國ATCC），用含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至密度約為80%～90%時，將細(xì)胞分別接種于不同孔徑的孔板中，待細(xì)胞生長至密度約為70%～80%時，進(jìn)行不同劑量（20、40、60 μmol/L）的木犀草素處理。

1.2實(shí)驗(yàn)分組將A375和B16F10細(xì)胞分別分為4組：對照組、木犀草素20 μmol/L組、木犀草素40 μmol/L組、木犀草素60 μmol/L組。

1.3CCK?8檢測將對數(shù)期細(xì)胞以5×103/孔接種于96孔板，每組設(shè)4個復(fù)孔。在木犀草素處理0、24、48、72 h時分別進(jìn)行CCK?8檢測。每孔加入100 μL含10%CCK?8試劑的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)1 h，然后用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長下的OD值。

1.4Transwell實(shí)驗(yàn)細(xì)胞貼壁后進(jìn)行60 μmol/L的木犀草素處理，24 h后消化收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，更換無血清培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/mL。在預(yù)鋪有matrigel膠的Millicell insert上室中加入200 μL細(xì)胞懸液，下室中加入含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，共培養(yǎng)24 h后，取出上室，棉簽擦去上室的殘留細(xì)胞，90%酒精常溫固定30 min，0.1%結(jié)晶紫常溫染色10 min。倒置顯微鏡照相并計(jì)數(shù)。

1.5流式細(xì)胞儀檢測將對數(shù)期細(xì)胞以2×105/孔的密度接種于6孔板，每組設(shè)4個復(fù)孔。在60 μmol/L的木犀草素處理48 h時，每孔分別加入5 μL An?nexin V?FITC 和 5 μL PI試劑，輕輕搖勻后閉光孵育15 min，于1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.6Western blot將對數(shù)期細(xì)胞以2×104/孔接種于24孔板，當(dāng)60 μmol/L的木犀草素處理48 h后進(jìn)行Western Blot檢測。用RIPA裂解液（含PMSF）裂解細(xì)胞，離心收集上清，然后用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。通過SDS?PAGE凝膠電泳分離蛋白，然后通過半干轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。隨后經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后，加入Bcl?2（1∶500）、Bax（1∶500）、Caspase?3（1∶500）、VEGF（1∶1000）、p?Akt（1∶1000）、Akt（1∶1000）、p?mTOR（1∶1000）和mTOR（1∶1000）等一抗4℃孵育過夜。然后加入相應(yīng)二抗（1∶10000）室溫孵育1 h，Odys?sey紅外激光成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描。GAPDH表達(dá)量作為內(nèi)參。

1.7RT?PCR將對數(shù)期細(xì)胞以2×104/孔接種于24孔板，當(dāng)60 μmol/L的木犀草素處理48 h后進(jìn)行RT?PCR檢測。用Trizol試劑提取細(xì)胞RNA，用紫外分光光度計(jì)定量。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板檢測VEGF的mRNA水平。反應(yīng)程序如下：94℃，5 min；變性 94℃，30 s；退火57℃，30 s；延伸72℃，30 s；40個循環(huán)。以β?actin 作為內(nèi)參，采用 2?△△Ct法比較分析mRNA水平。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)均采用x±s表示，單因素方差分析各組間的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1木犀草素抑制黑素瘤細(xì)胞的增殖如圖1A所示，與對照組 HEK293T 細(xì)胞相比，20、40、60 μmol/L木犀草素處理72 h對HEK293T細(xì)胞的增殖活力無顯著影響，說明這3個濃度的木犀草素對正常細(xì)胞沒有生長抑制作用，無細(xì)胞毒性。與對照組相比，20、40、60 μmol/L木犀草素處理能夠顯著抑制A375和B16F10細(xì)胞的增殖，而且抑制效果具有藥物濃度和時間依賴性，木犀草素濃度越高，處理時間越長，增殖抑制效果越明顯（圖1B、1C），所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇60 μmol/L木犀草素處理48 h為處理?xiàng)l件。

2.2木犀草素促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞的凋亡如圖2A、2B所示，與對照組相比，60 μmol/L木犀草素處理48 h后，A375和B16F10細(xì)胞的凋亡率顯著提高。如圖2C、2D所示，與對照組相比，木犀草素60 μmol/L組Bcl?2的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，而Bax和Caspase?3的表達(dá)顯著上調(diào)。

2.3木犀草素抑制黑素瘤細(xì)胞的侵襲通過Transwell實(shí)驗(yàn)對細(xì)胞的侵襲能力進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，在A375和B16F10兩種細(xì)胞系中，與對照組相比，木犀草素60 μmol/L組侵襲的細(xì)胞數(shù)目顯著減少（圖3）。

2.4木犀草素抑制黑素瘤細(xì)胞中VEGF的表達(dá)如圖4所示，在A375和B16F10兩種細(xì)胞系中，與對照組相比，木犀草素60 μmol/L組VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低。

2.5木犀草素抑制PI3K?Akt?mTOR信號通路如圖5所示，在A375和B16F10兩種細(xì)胞系中，與對照組相比，木犀草素60 μmol/L組p?Akt和p?mTOR的蛋白表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Akt和mTOR的蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

木犀草素是一種具有多種藥理活性的天然黃酮化合物，在多種癌癥中都有顯著的抗癌作用［10］。本研究首次探討了木犀草素在黑素瘤細(xì)胞A375和B16F10中是否也發(fā)揮抗腫瘤作用，旨在為CMM的治療提供新的方向和依據(jù)。

凋亡是細(xì)胞主動發(fā)生地程序化死亡，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素能夠通過抗增殖和誘導(dǎo)凋亡來抑制惡性腫瘤細(xì)胞的生長［11］。因此筆者通過CCK?8檢測細(xì)胞增殖，發(fā)現(xiàn)木犀草素可以顯著抑制A375和B16F10細(xì)胞的增殖，且抑制效果呈濃度、時間依賴性。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，木犀草素能夠誘導(dǎo)A375和B16F10細(xì)胞的凋亡。有文獻(xiàn)表明，木犀草素能夠通過內(nèi)源性途徑，包括增加Caspase?3水平，以及提高Bax/Bcl?2表達(dá)比例，來誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡［12］。與該研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比，木犀草素組的Bcl?2蛋白水平明顯下調(diào)，而Bax和cleaved?Caspase?3的表達(dá)明顯上調(diào)。以上研究結(jié)果說明，木犀草素能夠通過抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抗黑素瘤作用。

圖3 木犀草素對A375和B16F10細(xì)胞侵襲的影響Fig.3 Effect of luteolin on the invasionof A375 and B16F10 cells

圖4 木犀草素對A375和B16F10細(xì)胞中VEGF表達(dá)的影響Fig.4 Effect of luteolin on the VEGF expression in A375 and B16F10 cells

腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲運(yùn)動的能力與黑素瘤預(yù)后密切相關(guān)，遷移和侵襲運(yùn)動的能力越強(qiáng)，腫瘤越易早期轉(zhuǎn)移，預(yù)后越差。研究表明，木犀草素對腫瘤細(xì)胞的侵襲能力也有顯著的抑制作用［4］，與該研究結(jié)果一致，本研究通過Transwell檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，木犀草素處理顯著降低A375和B16F10細(xì)胞的侵襲能力。文獻(xiàn)報道，VEGF在CMM中過表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，而抑制VEGF表達(dá)能夠減少新生血管的生成，從而抑制細(xì)胞增殖和侵襲［13］。有文獻(xiàn)報道，木犀草素發(fā)揮抗癌作用還與其抑制血管生成作用有關(guān)［6］。與以上研究結(jié)果一致，木犀草素能夠顯著降低A375和B16F10細(xì)胞中VEGF的表達(dá)。以上研究結(jié)果表明，木犀草素能夠通過抑制細(xì)胞侵襲，降低VEGF的表達(dá)來發(fā)揮抗黑素瘤作用。

圖5 木犀草素對A375和B16F10細(xì)胞中p?Akt、Akt、p?mTOR和mTOR表達(dá)的影響Fig.5 Effect of luteolin on the p?Akt，Akt，p?mTOR and mTORexpression in A375 and B16F10 cells

本文以上研究結(jié)果已經(jīng)表明，木犀草素具有抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖、侵襲、VEGF表達(dá)，且促進(jìn)細(xì)胞凋亡的生物學(xué)作用，因此我們進(jìn)一步初步探討潛在的分子機(jī)制。PI3K/Akt/mTOR信號通路與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞遷移、蛋白合成、能量代謝等眾多生命活動［14］，在黑素瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的調(diào)控作用［15］。研究表明，木犀草素通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路在人絨毛膜癌細(xì)胞的治療中發(fā)揮重要作用［16］。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)木犀草素能夠抑制A375和B16F10細(xì)胞中p?Akt和p?mTOR的蛋白水平，與前人研究結(jié)果一致，說明木犀草素對黑素瘤細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的調(diào)控可能與抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路有關(guān)。

綜上所述，本研究證實(shí)了木犀草素具有抗黑素瘤的能力，能夠抑制黑素瘤細(xì)胞A375和B16F10的增殖和侵襲能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這可能與其降低VEGF表達(dá)，抑制PI3K?Akt?mTOR信號通路的作用有關(guān)。該發(fā)現(xiàn)為木犀草素在CMM治療上的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。但是，本研究僅在體外細(xì)胞水平證實(shí)了木犀草素的抗黑素瘤作用，后期仍需在體內(nèi)明確其作用，且還需更加詳細(xì)地闡明其分子調(diào)控機(jī)制。