張藝?guó)?，姜曉?*，于 濤，孫麗瀅

（1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007；2.新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.佛山市海天調(diào)味食品股份有限公司，廣東 佛山 528000）

綠色魏斯氏菌（Weissella viridescens）[1]屬于乳桿菌目（Lactobacillales）、明串珠菌科（Leuconostocaceae）、魏斯氏菌屬（Weissella）[2-4]。該菌在微觀和宏觀形態(tài)方面與乳酸菌的其他代表菌株相似，特別是容易與明串珠菌（Leuconostoc）和乳桿菌（Lactobacillus）[1]混淆。綠色魏斯氏菌為革蘭氏陽性菌，呈不規(guī)則的短桿狀，兩端呈圓形或稍細(xì)小，成對(duì)或短鏈排列[5]；在MRS瓊脂培養(yǎng)基上形成透明的小菌落，呈微隆起圓形輪廓[6]。

綠色魏斯氏菌屬于異型發(fā)酵乳酸菌，能夠?qū)е率称诽貏e是肉制品的腐敗變質(zhì)[1,6-7]。當(dāng)暴露于氧氣中時(shí)，一些肉制品，如香腸、真空包裝肉、煙熏肉等會(huì)出現(xiàn)變綠的現(xiàn)象。綠色魏斯氏菌是造成肉制品表面出現(xiàn)黏液并發(fā)綠的主要原因[1,6]。起初，黏液僅在單個(gè)菌落周圍出現(xiàn)，之后逐漸形成一整片綠色的黏液，并從肉制品的表面向內(nèi)部滲透。綠色魏斯氏菌已經(jīng)成為威脅肉制品質(zhì)量與安全的重要腐敗菌，給肉類加工行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。因此，建立快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)預(yù)防和控制綠色魏斯氏菌對(duì)食品的污染、保障食品質(zhì)量與安全具有重要意義。

目前，針對(duì)綠色魏斯氏菌的檢測(cè)方法十分有限。傳統(tǒng)的綠色魏斯氏菌檢測(cè)方法包括增菌培養(yǎng)、分離純化、鏡檢和生化鑒定等步驟，耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣且結(jié)果可靠性低[8-10]，嚴(yán)重影響檢測(cè)鑒定的效率[11-13]。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、靈敏、特異、快速、直觀、定量準(zhǔn)確、閉管反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)[14-16]。食源性致病菌的檢測(cè)多采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，其步驟冗繁，耗時(shí)費(fèi)力[17-19]。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法在食源性細(xì)菌檢測(cè)中已得到廣泛應(yīng)用[20-22]。Gómez-Rojo等[23]建立了針對(duì)綠色魏斯氏菌特異性基因recN的Taq Man探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，但還未見報(bào)道綠色魏斯氏菌特異性基因的SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法[24-25]。本研究以綠色魏斯氏菌特異性基因rpoA為靶基因，應(yīng)用常規(guī)PCR技術(shù)[26-27]和SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)[28]建立快速、準(zhǔn)確檢測(cè)綠色魏斯氏菌的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

所用菌株如表1所示，其中綠色魏斯氏菌、糞腸鏈球菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、大腸桿菌及單核細(xì)胞增生李斯特菌均為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株，融合魏斯氏菌、食物魏斯氏菌以及乳明串珠菌由中國(guó)海洋微生物菌種保藏管理中心提供。

表1 所用菌株及其來源Table 1 Strains used in this study

1.1.2 試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、熒光定量PCR試劑盒北京天根生化科技有限公司；用于PCR擴(kuò)增的試劑：Taq酶、10×PCR Buffer、dNTP、2 000 bp DNA Marker寶生物工程（大連）有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DH360電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京科偉永興儀器有限公司；THZ-82氣浴恒溫振蕩器 江蘇省金壇市天竟實(shí)驗(yàn)儀器廠；ETC811基因擴(kuò)增儀 北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；DYY-8C電泳儀 北京市六一儀器廠；TGL-16B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；DG-800旋渦混合器 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Universal Hood Ⅱ凝膠成像分析系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；LightCycler@96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 瑞士Roche公司；NanoDropTM2000微量分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌基因組DNA的提取

利用試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，利用分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度。具體操作如下：用移液槍取1 μL DNA樣品滴加到檢測(cè)平臺(tái)上，分別讀取樣品在260、280 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A），A260nm反映DNA樣品的濃度，A260nm和A280nm的比值（A260nm/A280nm）反映樣品的純度。

1.3.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

從GenBank中下載綠色魏斯氏菌的rpoA基因靶序列，登錄號(hào)為AM711320，應(yīng)用Dnaman軟件進(jìn)行同源性分析，確定在綠色魏斯氏菌菌株內(nèi)保守、其他菌株間特異的片段。應(yīng)用Primerpremier 5.0生物軟件設(shè)計(jì)1 對(duì)引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為196 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列：上游引物：5’-GATTTCGTTGGTGATGCTG-3’；下游引物：5’-CGATTGGGGTAAAGATTGA-3’。

1.3.3 PCR擴(kuò)增

1.3.3.1 常規(guī)PCR反應(yīng)體系

10×Buffer 2.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）2 μL、上下游引物各1.5 μL、Taq酶0.125 μL、DNA模板1 μL、無菌水補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，接著反應(yīng)30 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性40 s、51 ℃退火30 s、72 ℃延伸20 s，循環(huán)結(jié)束后，72 ℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并觀察結(jié)果。

1.3.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系

2×SuperReal PreMix Plus 12.5 μL、DNA模板1 μL、上下游引物各1.5 μL、無酶水（RNase-Free ddH2O），補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性：95 ℃、15 min；變性：95 ℃、10 s；退火：60 ℃、30 s；延伸：72 ℃、30 s；反應(yīng)進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。

1.3.4 特異性評(píng)價(jià)

以表1所列菌株的基因組DNA為模板，并用無菌水作為無模板空白對(duì)照，按照1.3.3節(jié)所述條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過觀察電泳條帶和擴(kuò)增曲線分別驗(yàn)證常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的特異性。

1.3.5 靈敏度評(píng)價(jià)

1.3.5.1 基因組DNA靈敏度評(píng)價(jià)

將已知濃度的綠色魏斯氏菌基因組DNA進(jìn)行10 倍梯度稀釋，每個(gè)稀釋度的DNA樣品各取1 μL為模板，按照

1.3.3 節(jié)所述條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能得到肉眼可見條帶或明顯擴(kuò)增曲線（“S”型擴(kuò)增曲線）的最低濃度即為PCR檢測(cè)體系靈敏度。

1.3.5.2 純培養(yǎng)物檢測(cè)靈敏度評(píng)價(jià)

綠色魏斯氏菌經(jīng)純培養(yǎng)后，用MRS培養(yǎng)基做10 倍梯度稀釋，并選擇10－5、10－6和10－73 個(gè)稀釋度做平板計(jì)數(shù)，以此計(jì)算原始菌落數(shù)。同時(shí)每個(gè)稀釋度各取3 mL菌液提取DNA，取1 μL為模板，按照1.3.3節(jié)所述條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能得到肉眼可見條帶或明顯擴(kuò)增曲線（“S”型擴(kuò)增曲線）的最低濃度即為PCR檢測(cè)體系靈敏度。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)

將已知濃度的綠色魏斯氏菌基因組DNA進(jìn)行10 倍梯度稀釋，每個(gè)稀釋度的DNA樣品各取1 μL為模板，按照1.3.3.2節(jié)所述條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增（每個(gè)濃度梯度3 個(gè)平行），以循環(huán)閾（circulation threshold，Ct）值為縱坐標(biāo)，DNA模板量的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

再以10 倍梯度稀釋的綠色魏斯氏菌基因組DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，獨(dú)立重復(fù)3 次，評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算模板的濃度，并將計(jì)算值與理論值進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)定量結(jié)果的可靠性。

1.3.7 人工污染食品樣品檢測(cè)

取綠色魏斯氏菌菌液進(jìn)行10 倍梯度稀釋，選擇10-5、10-6和10-73 個(gè)稀釋度做平板計(jì)數(shù)，計(jì)算純培養(yǎng)物的初始菌落數(shù)。取若干個(gè)稀釋度（原液、10-1～10-8）的菌液各1 mL添加到25 g無菌牛肉樣品中，加入40 mL蛋白胨水，均質(zhì)2 min；取40 mL均質(zhì)液，2 000 r/min離心10 min以沉淀食品雜質(zhì)；吸取上清液轉(zhuǎn)移至干凈無菌的離心管中，10 000 r/min離心3 min后，緩慢倒掉上清液，獲得菌體沉淀，用于基因組DNA的提?。蝗? μL作為模板，按照1.3.3節(jié)所述條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能得到肉眼可見條帶或明顯擴(kuò)增曲線的最低濃度即為PCR檢測(cè)體系靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)PCR及實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的特異性

表2 菌株常規(guī)PCR及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果Table 2 Routine PCR and real-time quantitative PCR detection results

圖1 綠色魏斯氏菌常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果Fig. 1 Detection of Weissella viridescens by conventional PCR

以建立的常規(guī)PCR體系對(duì)表1所列的菌株進(jìn)行檢測(cè)。由表2及圖1可知，只有綠色魏斯氏菌反應(yīng)結(jié)果為陽性，且擴(kuò)增出196 bp的目的產(chǎn)物。

圖2 綠色魏斯氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線Fig. 2 Amplification curve of quantitative real-time PCR for Weissella viridescens

圖3 綠色魏斯氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線Fig. 3 Melting curve of quantitative real-time PCR for Weissella viridescens

利用本研究建立的綠色魏斯氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)表1所列菌株進(jìn)行檢測(cè)。由圖2～3可知，只有綠色魏斯氏菌能夠產(chǎn)生典型的“S”型擴(kuò)增曲線，綠色魏斯氏菌的熔解曲線均在85 ℃出現(xiàn)1 個(gè)目標(biāo)條帶特異熔解峰，表明所用引物的特異性強(qiáng)，并且穩(wěn)定性良好。

2.2 靈敏度

2.2.1 基因組DNA靈敏度

圖4 綠色魏斯氏菌基因組DNA常規(guī)PCR靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig. 4 Sensitivity evaluation of conventional PCR for genomic DNA from Weissella viridescens

經(jīng)過測(cè)定可知綠色魏斯氏菌基因組DNA的質(zhì)量濃度為267 ng/μL。由圖4可知，對(duì)于常規(guī)PCR體系，當(dāng)綠色魏斯氏菌基因組DNA質(zhì)量濃度低至2.667 pg/μL時(shí)仍能觀察到1 條擴(kuò)增條帶，表明該方法的檢測(cè)下限為2.667 pg/μL。

圖5 綠色魏斯氏菌基因組DNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線Fig. 5 Amplification curve of quantitative real-time PCR for genomic DNA from Weissella viridescens

由圖5可知，對(duì)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系，當(dāng)綠色魏斯氏菌基因組DNA模板質(zhì)量濃度低至2.667×10-3pg/μL時(shí)仍能觀察到明顯的擴(kuò)增曲線，因此該方法的檢測(cè)下限為2.667×10-3pg/μL。

2.2.2 純培養(yǎng)物DNA靈敏度

表3 純培養(yǎng)物DNA檢測(cè)靈敏度測(cè)定結(jié)果Table 3 Results of sensitivity evaluation for DNA of pure bacterial culture

通過平板計(jì)數(shù)可知，綠色魏斯氏菌純培養(yǎng)物的初始菌液濃度為3×109CFU/mL。由表3可知：對(duì)于常規(guī)PCR體系，當(dāng)純培養(yǎng)物濃度低至3×104CFU/mL時(shí)仍能觀察到擴(kuò)增條帶，表明該方法的靈敏度為3×104CFU/mL，即30 CFU/PCR反應(yīng)；對(duì)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系，當(dāng)純培養(yǎng)物濃度低至30 CFU/mL時(shí)仍能觀察到擴(kuò)增曲線，則該方法的靈敏度為30 CFU/mL。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)1.3.6節(jié)單獨(dú)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.46x＋16.30（R2=0.99）。曲線呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，定量準(zhǔn)確。

2.3.2 獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

由表4可知：梯度稀釋DNA 3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值標(biāo)準(zhǔn)差均小于1，變異系數(shù)為0.02%～1.28%，說明檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性好；計(jì)算結(jié)果與理論計(jì)數(shù)處于同一數(shù)量級(jí)水平，說明定量準(zhǔn)確可靠。

表4 熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性Table 4 Accuracy analysis of the results of real time PCR detection

2.4 人工污染食品樣品檢測(cè)結(jié)果

表5 人工污染食品樣品檢測(cè)結(jié)果Table 5 Results of detection of artificial contaminated food samples

根據(jù)平板計(jì)數(shù)結(jié)果可知，綠色魏斯氏菌的初始菌液濃度為2×109CFU/mL。由表5可知：對(duì)于常規(guī)PCR體系，當(dāng)污染牛肉樣品的菌液濃度低至8×102CFU/g時(shí)仍能觀察到擴(kuò)增條帶，表明該方法的檢測(cè)下限為8×102CFU/g；對(duì)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系，當(dāng)污染牛肉樣品的菌液濃度低至0.8 CFU/g時(shí)仍能觀察到擴(kuò)增曲線，則該方法的檢測(cè)下限為0.8 CFU/g。

3 討 論

性能優(yōu)良的引物是建立準(zhǔn)確可靠的PCR檢測(cè)體系的前提，而優(yōu)良的引物則依賴于高度特異的檢測(cè)靶基因。在前期研究中，利用生物信息學(xué)方法，對(duì)綠色魏斯氏菌種內(nèi)及種間的DNA序列進(jìn)行比對(duì)，選擇了6 條綠色魏斯氏菌種內(nèi)保守、種間特異的序列。針對(duì)這些序列設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，最終選擇性能最好的1 對(duì)引物建立PCR檢測(cè)體系。該引物對(duì)應(yīng)的靶基因即為綠色魏斯氏菌的rpoA基因，該基因編碼DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶α亞基，參與DNA的復(fù)制過程，種內(nèi)高度保守。本研究根據(jù)綠色魏斯氏菌rpoA基因的保守片段設(shè)計(jì)引物，結(jié)果表明，基于rpoA基因的常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的特異性均為100%。

本研究所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的靈敏度達(dá)2.667×10－3pg/μL，對(duì)純培養(yǎng)物和模擬污染牛肉樣品直接檢測(cè)的靈敏度分別為30 CFU/mL和0.8 CFU/g。與常規(guī)PCR相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的靈敏度是其1 000 倍[29]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于綠色魏斯氏菌的快速檢測(cè)方法鮮有報(bào)道。西班牙學(xué)者Gómez-Rojo等[23]建立了針對(duì)綠色魏斯氏菌特異性基因recN的Taq Man探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法[30]，該方法的靈敏度為8.2×10-2pg/PCR，相應(yīng)的平均Ct值為40.0；在人工污染布爾格斯血腸樣品試驗(yàn)中，其檢測(cè)靈敏度為100 CFU/g，相應(yīng)的平均Ct值為41.6。Taq Man探針法需要專門合成特異性的探針，價(jià)格昂貴。相比之下，本研究建立的基于rpoA基因的綠色魏斯氏菌SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法靈敏度更高、成本低。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，變異系數(shù)為0.02%～1.28%，表明重復(fù)性良好，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法能對(duì)樣品進(jìn)行穩(wěn)定、可靠的檢測(cè)。與常規(guī)PCR相比，該方法不需要電泳檢測(cè)、不使用染料溴化乙錠，安全性更高。綠色魏斯氏菌在微觀和宏觀形態(tài)方面與明串珠菌和乳桿菌十分相似，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法有時(shí)也難以將其區(qū)分。本研究建立的綠色魏斯氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法具有很高的特異性，能充分保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

綜上所述，本研究所建立的綠色魏斯氏菌SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量。與探針法相比，成本更低，操作更方便，適合PCR技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化推廣。