張 科 杜 娟 牟 榮** 包懷恩

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室，貴州貴陽 550025； 2.貴州省教育廳貴州醫(yī)科大學(xué)現(xiàn)代病原生物學(xué)特色重點實驗室，貴州貴陽 550025)

亞洲帶絳蟲Taeniaasiatica是近40年來在東南亞和西亞太平洋地區(qū)發(fā)現(xiàn)的新的帶絳蟲(包懷恩，2002；包懷恩等，2009；Itoetal., 2015)。亞洲帶絳蟲的中間宿主是家豬或野豬，感染途徑是生食含有活囊尾蚴的豬肝或內(nèi)臟，成蟲寄生于人體腸道并引起亞洲帶絳蟲病(張科等，2006)。近年來流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)亞洲帶絳蟲感染導(dǎo)致絳蟲病的病例報道屢見不鮮(龍昌平等，2014；Kimetal., 2017)，其原因可能與原住民固有飲食習(xí)慣，以及對寄生蟲致病知識缺乏了解等密切相關(guān)。亞洲帶絳蟲引起的絳蟲病已成為一種重要的食源性寄生蟲病(包懷恩，2002)。食源性寄生蟲病是指通過食用被寄生蟲感染或污染的食物而傳播的疾病(姜培珍等，2009)，關(guān)于亞洲帶絳蟲，生活史目前已明晰，但是對于影響其幼蟲活性的各種化學(xué)因素，即烹飪過程中各種調(diào)料、佐餐酒精飲品及飲料等對亞洲帶絳蟲囊尾蚴活性的影響，目前缺乏相關(guān)研究及文獻報道。近來中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)所研究團隊運用二代測序技術(shù)成功解析亞洲帶絳蟲和牛帶絳蟲T.saginata基因組，確認了亞洲帶絳蟲和牛帶絳蟲極近的進化關(guān)系(Wangetal., 2016)，而有國外文獻報道T.saginata囊尾蚴在食醋中只能存活5 min，在白酒中卻可以存活110 min (Ghebrekidan，1992)，另一篇文獻同樣報道T.saginata囊尾蚴在食醋中只能存活5 min，在大蒜中可存活10 min，在檸檬汁中可存活40 min (Mohamoudetal.，2003)。這提示牛肉中的囊尾蚴不經(jīng)過烹飪和高溫蒸煮，在餐桌上是相當(dāng)危險的。因此，本研究在建立亞洲帶絳蟲囊尾蚴實驗感染動物模型的基礎(chǔ)上，采用日常生活常用調(diào)料、酒精飲品和飲料對亞洲帶絳蟲囊尾蚴進行體外實驗，研究其囊尾蚴在常用調(diào)料、酒精飲品和飲料中存活情況。研究結(jié)果將有助于提倡健康飲食，指導(dǎo)人們改變不良飲食習(xí)慣，為防治亞洲帶絳蟲感染導(dǎo)致的食源性寄生蟲病提供具有指導(dǎo)意義的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標(biāo)本: 于貴州省都勻市采用檳榔—南瓜子法對近期有排節(jié)片患者驅(qū)蟲，共采集到4條疑似帶絳蟲樣本，分別命名為都勻1號、都勻2號、都勻3號和都勻4號。蟲體以自來水和生理鹽水漂洗后置于過濾除菌的生理鹽水中4 ℃保存，隨后進行形態(tài)學(xué)觀察和測量，并以DNA提取試劑盒提取孕節(jié)碎片組織DNA，分別以亞洲帶絳蟲和牛帶絳蟲cox1基因片段的特異性引物進行了PCR擴增，綜合形態(tài)學(xué)觀察測量和PCR結(jié)果，該4條疑似帶絳蟲樣本均鑒定為亞洲帶絳蟲(杜娟，2012；杜娟等，2013)。

1.1.2實驗動物: 本實驗使用清潔級4～6周齡雌性昆明小鼠252只，體重18～24 g，購自貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，合格證號為SCXK(京)2009-0004。動物實驗獲得貴州醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.3主要試劑: 胃蛋白酶和胰蛋白酶均購自上海源聚生物科技有限公司(貨號：E1630和 E2080)；地塞米松注射液購自貴州遠康制藥股份有限公司。50%豬膽汁為自農(nóng)貿(mào)市場購買豬膽數(shù)個，無菌注射器抽出膽汁，按1∶1體積比將膽汁與無菌生理鹽水混合后無菌密封，4 ℃保存待用。

1.1.4用于本實驗的調(diào)料: 食醋(醋酸濃度4.5%，pH3.05)；醬油(含19.3% NaCl)；食鹽水：將10 g食鹽加入100 mL無菌雙蒸水配制得到10%食鹽水、將30 g食鹽加入100 mL無菌雙蒸水配制得到30%食鹽水；辣椒水：將10 g辣椒粉加入100 mL無菌雙蒸水配制得到10%辣椒水；此外，自農(nóng)貿(mào)市場購買生姜、大蒜和檸檬數(shù)斤至數(shù)十斤不等，分別洗凈晾干切片后放入榨汁機榨取100%生姜汁、100%大蒜汁和100%檸檬汁。上述調(diào)料制成后均分別無菌密封，4 ℃保存待用。上述調(diào)料均隨機購自貴州省貴陽市農(nóng)貿(mào)市場。

1.1.5用于本實驗的酒精飲品: 白酒(酒精含量56.00%)；葡萄酒(酒精含量，9.50%～15.00%)；啤酒(酒精含量3.52%～4.80%)。上述酒精飲品均隨機購自貴州省貴陽市農(nóng)貿(mào)市場。

1.1.6用于本實驗的飲料: 鮮橙多(成分：水、白砂糖、橙濃縮汁、檸檬酸、蘋果酸、檸檬酸鈉、維生素C、D-異抗壞血酸鈉、β-胡蘿卜素、阿拉伯膠、食用香精)；營養(yǎng)快線(成分：水、全脂乳粉、白砂糖、濃縮蘋果汁、食用增稠劑、穩(wěn)定劑、食用香精、乙基麥芽酚、阿斯巴甜、安賽蜜、乳酸鏈球菌素、?；撬?、維生素E、煙酰胺、維生素B6、維生素A、維生素D、維生素B12)；可樂(成分：水、焦糖、酸橙汁、磷酸等)。上述飲料均隨機購自貴州省貴陽市農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本處理: 無菌生理鹽水清洗蟲體3次，取孕節(jié)剪碎，混懸于適量生理鹽水中，0.106 mm孔徑不銹鋼篩網(wǎng)過濾蟲卵，生理鹽水洗滌蟲卵3次后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2亞洲帶絳蟲囊尾蚴實驗感染動物模型建立: 參照文獻(陳利紅等，2005)建立感染動物模型，自感染前30 d開始，每只昆明小鼠每天皮下注射0.4 mg地塞米松，小鼠飼料、飲水和墊料均經(jīng)高溫消毒處理，每周以84消毒液對鼠籠行消毒處理2次。

1.2.3蟲卵孵化及六鉤蚴計數(shù): 參照文獻 (Stevensonetal., 1983) 方法孵化蟲卵。取12只試管，每管分別加入亞洲帶絳蟲蟲卵懸液2 mL及1%酸性胃蛋白酶溶液10 mL，加蓋后置于37 ℃水浴箱孵化90 min，每隔30 min重懸溶液1次，每次30 s，2 000 r/min離心20 min，棄上清，再分別加入0.05%胰蛋白酶的碳酸氫鈉溶液4 mL和50%豬膽汁2 mL，加蓋后置于37 ℃水浴箱孵化60 min，每隔10～20 min劇烈重懸1次，每次1 min。同時在顯微鏡下觀察蟲卵孵化情況。待約50%蟲卵孵出六鉤蚴后，將12只試管的孵化液集中于1個離心管內(nèi)，1 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀中再加入無菌生理鹽水，1 000 r/min離心10 min，棄上清，如此反復(fù)7次，最后收集六鉤蚴沉淀備用。六鉤蚴沉淀混勻后取100 μL混懸液，加入10 μL 0.4%臺盼藍染色，活六鉤蚴不著色，死亡六鉤蚴將被染成藍色，以血細胞計數(shù)板計數(shù)活六鉤蚴含量，混勻后反復(fù)計數(shù)3次取均值。

1.2.4實驗感染: 將活六鉤蚴濃度調(diào)節(jié)至5 000個/mL，每只昆明小鼠皮下注射1 mL該六鉤蚴溶液，該日即為感染起始日，于感染后第60 d對小鼠進行剖殺，獲取成熟囊尾蚴。

1.2.5常用調(diào)料對亞洲帶絳蟲囊尾蚴死亡率的影響: 將生理鹽水、食醋、10%食鹽水、30%食鹽水、食用醬油、100%生姜汁、100%大蒜汁、10%辣椒水和100%檸檬汁于常溫下體外作用于亞洲帶絳蟲囊尾蚴，上述調(diào)料各150 mL分別加入含12個亞洲帶絳蟲囊尾蚴的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿以塑料蓋子覆蓋防止液體揮發(fā)，作用時間分別設(shè)定為1、3、5、10、15、25、30和40 min，作用完后將囊尾蚴以清水徹底沖洗3次，再放入含50%豬膽汁的培養(yǎng)皿中37 ℃培養(yǎng)48 h觀察頭節(jié)翻出情況，測定死亡率，同時設(shè)立生理鹽水處理組為陰性對照組。

1.2.6常用酒精飲品對亞洲帶絳蟲囊尾蚴死亡率的影響: 將150 mL白酒、啤酒和紅酒于常溫下分別加入含12個亞洲帶絳蟲囊尾蚴的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿以塑料蓋子覆蓋防止液體揮發(fā)，作用時間分別設(shè)定為1、3、5、10、30、60、90和120 min，作用完后將囊尾蚴以清水徹底沖洗3次，再置于50%豬膽汁中37 ℃培養(yǎng)48 h觀察頭節(jié)翻出情況，測定死亡率，同時設(shè)立生理鹽水處理組為陰性對照組。

1.2.7常用飲料對亞洲帶絳蟲囊尾蚴死亡率的影響: 將150 mL鮮橙多、營養(yǎng)快線和可樂于常溫下分別加入含12個亞洲帶絳蟲囊尾蚴的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿以塑料蓋子覆蓋防止液體揮發(fā),作用時間分別設(shè)定為1、5、10、30、60、90、120和180 min，作用完后將囊尾蚴以清水徹底沖洗3次，再放入50%豬膽汁中37 ℃培養(yǎng)48 h觀察頭節(jié)翻出情況，測定死亡率，同時設(shè)立生理鹽水處理組為陰性對照組。

1.2.8數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析: 以室溫下膽汁培養(yǎng)48 h后生理鹽水中不能翻出頭節(jié)的囊尾蚴描述為死亡，可翻出頭節(jié)視為存活，死亡率=(死亡囊尾蚴數(shù)/囊尾蚴總數(shù))×100%。處理后的囊尾蚴死亡率均采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析處理，P<0.05認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 建立亞洲帶絳蟲囊尾蚴實驗感染動物模型

皮下注射0.4 mg地塞米松/日/只小鼠，免疫抑制小鼠252只，均按5 000個六鉤蚴/只感染，其中有119只小鼠可在皮下檢出囊尾蚴(圖1)，感染成功率為47.22%，共檢獲囊尾蚴1 769個，大小為(1.7±0.1)mm×(3.25±0.25)mm(部分囊尾蚴見圖1)，六鉤蚴回收率為0.14%。

圖1 亞洲帶絳蟲囊尾蚴實驗感染動物模型Fig.1 The experimental infection mouse model of Taenia asiatica左圖：黑色箭頭示感染60 d后小鼠皮下亞洲帶絳蟲囊尾蚴；右圖：剝離出的亞洲帶絳蟲囊尾蚴。Left panel: The Taenia asiatica cysticerci from subcutaneous tissue of mouse was demonstrated by the black arrow at day 60 post-infection；Right panel: Taenia asiatica cysticerci were isolated from subcutaneous tissue of infected mice.

2.2 常用調(diào)料、酒精飲品和飲料對亞洲帶絳蟲囊尾蚴死亡率的影響

根據(jù)常用調(diào)料對亞洲帶絳蟲囊尾蚴死亡率的影響(表1)顯示，相對于生理鹽水對照組，食醋與30%食鹽水分別處理囊尾蚴5 min后死亡率均達100%，殺滅作用最佳，10%食鹽水和50%蒜汁需處理10 min后囊尾蚴方全部死亡，而醬油、100%姜汁、10%辣椒水和100%檸檬汁分別處理并殺滅全部囊尾蚴的時間分別是15、30、40和40 min。上述數(shù)據(jù)均具統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

據(jù)常用酒精飲品對亞洲帶絳蟲囊尾蚴死亡率的影響(表2)顯示，相對于生理鹽水對照組，酒精含量56%白酒處理1 min后囊尾蚴死亡率即達到41.67%，3 min后死亡率達到75%，5 min后死亡率達到100%；但酒精含量3.52%～4.80%的啤酒與酒精含量9.5%～15%的紅酒分別需要與亞洲帶絳蟲囊尾蚴作用90和120 min方能致死全部囊尾蚴。上述數(shù)據(jù)均具統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

根據(jù)常用飲料對亞洲帶絳蟲囊尾蚴死亡率的影響(表3)顯示，相對于生理鹽水對照組，鮮橙多、營養(yǎng)快線和可樂均不能引起顯著的亞洲帶絳蟲囊尾蚴死亡，其致死率數(shù)據(jù)不具統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 常用調(diào)料對亞洲帶絳蟲囊尾蚴死亡率的影響(%)Tab.1 The mortality rate of Taenia asiatica cysticerci treated with different sauces (%)

**：生理鹽水對照組；*：與生理鹽水對照組比較P<0.05。**: Saline group as control;*:P<0.05.

表2 常用酒精飲品對亞洲帶絳蟲囊尾蚴死亡率的影響(%)Tab.2 The mortality rates of Taenia asiatica cysticerci treated with different alcohol beverages (%)

**：生理鹽水對照組；*：與生理鹽水對照組比較P<0.05。**: Saline group as control;*:P<0.05.

表3 常用飲料對亞洲帶絳蟲囊尾蚴死亡率的影響(%)Tab.3 The mortality rates of Taenia asiatica cysticerci treated with different soft beverages (%)

**：生理鹽水對照組。**: Saline group as control.

3 討論

根據(jù)Ghebrekidan(1992)及Mohamoud等(2003)以牛帶絳蟲囊尾蚴作為實驗對象與食醋、大蒜、啤酒和紅酒的結(jié)果報道，分別需要5、10、90和105 min方能殺滅囊尾蚴，該結(jié)果與本實驗的結(jié)果基本吻合。但是，本實驗結(jié)果顯示白酒處理亞洲帶絳蟲囊尾蚴5 min即可殺滅，與Ghebrekidan(1992)報道的白酒處理牛帶絳蟲囊尾蚴110 min殺滅明顯不同，其主要原因可能是國產(chǎn)白酒與國外產(chǎn)白酒在釀造工藝上有差異，而本實驗用的白酒酒精度達56.00%，該推測尚需進一步實驗證實。此外，本實驗結(jié)果顯示啤酒殺滅囊尾蚴效果優(yōu)于紅酒，而啤酒酒精度(3.52%～4.80%)一般均低于紅酒酒精度(9.50%～15.00%)，鑒于白酒(酒精度56.00%)于本實驗中殺滅囊尾蚴效果較好，因此我們推測酒精度低于一個閾值對于囊尾蚴的殺滅效果將有較大影響，而且白酒、啤酒和紅酒釀造原料、釀造工藝均有較大不同，因此造成了這個結(jié)果。該推測尚需進一步實驗證實。

本研究發(fā)現(xiàn)酒精濃度56%的白酒、醋酸含量4.5%的食醋以及30%食鹽水對亞洲帶絳蟲囊尾蚴具有最佳殺滅效果(表1, 2)，能夠在短時間內(nèi)顯著滅活囊尾蚴，該實驗結(jié)果提示在生食或半生食動物內(nèi)臟如豬肝等時，適量飲用高濃度白酒，或以高濃度白酒、食醋和高濃度食鹽水做調(diào)料腌制動物內(nèi)臟后再食用，有可能降低亞洲帶絳蟲感染的風(fēng)險。此外，100%蒜汁、醬油和10%辣椒水也對亞洲帶絳蟲囊尾蚴具一定的殺滅作用，結(jié)合相關(guān)研究顯示大蒜液相粗提物(Alliumsativum, 系將一定量蒜與等量蒸餾水混合后搗碎，過濾雜質(zhì)后的水相液)對于微小膜殼絳蟲Hymenolepisnana感染和藍氏賈第鞭毛蟲Giardialamblia感染均有一定治療效果(Soffaretal., 1991；Fallahietal., 2016)，說明一些常用調(diào)料可能對絳蟲囊尾蚴具有殺滅作用。但是100%姜汁、100%檸檬汁、啤酒和紅酒對亞洲帶絳蟲囊尾蚴的殺滅作用較差，而以鮮橙多、營養(yǎng)快線和可樂為代表的常用飲料對亞洲帶絳蟲囊尾蚴不具殺滅作用(表3)。同時有報道顯示60 ℃熱處理5 min可以使水泡帶絳蟲T.hydatigena蟲卵六鉤蚴活性降低99.47%(Buttaretal., 2013)，提示我們在下一步的研究中應(yīng)考慮食物加熱條件下囊尾蚴與常用調(diào)料、酒精飲品和飲料的相互作用，應(yīng)可作為本研究的有益補充。

我國幅員遼闊，民族眾多，各地區(qū)各民族均有一定的特嗜食物和特殊飲食方法，因此衛(wèi)生工作者應(yīng)理解吃生肉和生動物內(nèi)臟并非某地區(qū)或某民族的生活或文化落后，而是傳統(tǒng)習(xí)俗，無可厚非。本研究采用日常生活常用調(diào)料、酒精飲品和飲料對亞洲帶絳蟲囊尾蚴進行了體外實驗，該研究對于餐桌上的亞洲帶絳蟲感染防治，以及指導(dǎo)居民改變不良飲食習(xí)慣和倡導(dǎo)健康飲食等具有較重要意義。此外，雖然高濃度白酒、食醋和高濃度食鹽水在體外對亞洲帶絳蟲囊尾蚴具有較強的殺滅作用，但其實際效果可受處理時間長短以及肉塊大小等多種因素的影響。因此，在有食生肉或動物內(nèi)臟習(xí)俗的地區(qū)，應(yīng)深入開展健康教育，提高居民自我保護意識，并加強對肉類和動物制品的檢驗檢疫(陳利紅等，2005)，以確保食品安全。