劉 倩，彭 琪，謝明玉，蔣再學(xué)，陸小梅，賴 茅，陳秀英

(1.東莞市兒科研究所，廣東 東莞 523325；2.東莞市兒童醫(yī)院，廣東 東莞 523325；3.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510080)

本文通過(guò)利用腸道病毒71型(EV71)陽(yáng)性患者抗血清進(jìn)一步對(duì)動(dòng)物模型的中和表位肽進(jìn)行篩選，研究動(dòng)物中確定的表位肽與人抗血清的反應(yīng)特征，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料：本研究選擇2014年11月～2015年6月東莞市兒童醫(yī)院手足口病入院患兒，經(jīng)Taqman熒光探針PCR檢測(cè)為腸道病毒通用型陽(yáng)性，且EV71陽(yáng)性的急性感染患兒。

1.2多肽序列及偶聯(lián)：本研究選取小鼠和兔子動(dòng)物模型篩選到的三個(gè)EV71中和表位肽SP55、SP70、VP2-28，并應(yīng)用MEGA5.0軟件將多肽序列與中國(guó)流行EV71的C4亞型進(jìn)行序列比對(duì)。

1.3研究方法

1.3.1體外微量中和實(shí)驗(yàn)：取50 μl患兒血清按倍比稀釋至96孔板中，加入100 TCID50 EV71病毒50 μg，37℃孵育1 h，加入Vero細(xì)胞，2×104細(xì)胞/孔。5% CO2，37℃培養(yǎng)4 d。觀察病變情況，以未發(fā)生病變的最大稀釋度作為血清的抗病毒滴度。

1.3.2酶聯(lián)免疫反應(yīng)：合成多肽使用碳酸緩沖液稀釋至5 μg/ml，50 μl/孔，4℃包被過(guò)夜。2%BSA 37℃封閉1 h。棄封閉液，血清標(biāo)本20 μl用含1%BSA的抗體稀釋液按4倍稀釋7個(gè)梯度，每孔加入抗體100 μl，每孔3個(gè)平行，37℃孵育1 h。PBST洗滌6次，5 min/次。羊抗人IgG二抗以及羊抗人IgM二抗用抗體稀釋液按1∶1 000稀釋，并等體積混合，每孔加入二抗100 μl，37℃孵育1 h，PBST洗滌6次，5 min/次。

2 結(jié)果

2.1EV71急性感染患兒血清采集：本研究從2014年11月～2015年6月，在EV71急性感染患兒的血清樣本中，經(jīng)過(guò)體外微量中和實(shí)驗(yàn)，篩選到13個(gè)中和抗體滴度較高的血清樣本。其中中和抗體滴度為2 048倍的8個(gè)，4 096倍的4個(gè)，8 192倍的1個(gè)。

2.2EV71中和表位多肽序列比對(duì)、合成及偶聯(lián)：分別在3個(gè)表位肽的N端和C端進(jìn)行BSA偶聯(lián)，N端記為B-SP70、B-SP55和B-VP2-28，C端記為SP70-B、SP55-B以及VP2-28-B。見(jiàn)表1。

多肽名稱參考序列合成序列SP55PESRESLAWQTATNPPDSRESLAWQTATNPSP70YPTFGEHKQEKDLEYYPTFGEHKQEKDLEYVP2-28AGGTGTEDSHPPYKQAGGTGTEDTHPPYKQ

2.3ELISA分析抗血清中EV71抗體滴度：通過(guò)ELISA對(duì)人抗血清中EV71的抗體滴度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)隨著抗血清的中和滴度從2 048倍升高到8 194倍，EV71的抗體滴度也隨之增高。見(jiàn)圖1。

圖1 EV71抗血清中和抗體滴度與病毒抗體滴度趨勢(shì)分析

2.4ELISA分析EV71動(dòng)物模型中和表位肽在人抗血清中的抗體滴度：將偶聯(lián)有BSA的中和表位肽SP55、SP70和VP2-28通過(guò)ELISA的方法分析人抗血清中各多肽的抗體滴度。見(jiàn)圖2。

A：中和表位肽SP55在人抗血清中的滴度；B：中和表位肽SP70在人抗血清中的滴度；C：中和表位肽VP2-28在人抗血清中的滴度；D：中和表位肽SP55-B、B-SP70以及B-VP2-28在人抗血清中的滴度比較圖2 N端和C端偶聯(lián)對(duì)多肽抗體滴度的影響

3 討論

EV71病毒屬于微小病毒科，無(wú)包膜的RNA病毒。病毒有4個(gè)衣殼蛋白VP1～4，其中VP1～3構(gòu)成衣殼的表面，而VP4與基因組RNA結(jié)合。12個(gè)VP1～3的五聚體構(gòu)成二十面體的立體對(duì)稱結(jié)構(gòu)[1-2]。EV71型病毒所致的手足口病(Hand foot and mouth disease，HFMD)極易發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥造成嚴(yán)重的不良結(jié)局[3]。不斷研究和探索EV71型病毒基因型及抗體對(duì)疾病的發(fā)病機(jī)制、疫苗研制以及臨床治療均具有重要的臨床意義和價(jià)值[4]。

表位肽SP55和SP70是EV71中較為重要的線性中和表位，但是由于其作用機(jī)制尚未明確，并且SP55和SP70在EV71病毒感染后能否誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體反應(yīng)仍存在一定的爭(zhēng)議[5]。Foo等人在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中表示，二者可誘導(dǎo)機(jī)體的抗體反應(yīng)[6]，而在潘青松的研究中表示，二者不能誘導(dǎo)相應(yīng)的中和抗體反應(yīng)[7]。此外研究證實(shí)，VP2-28是VP上與E1反應(yīng)強(qiáng)烈的肽鏈之一[8]，VP2-28對(duì)應(yīng)的單抗是MAB979，而MAB979對(duì)多種不同的基因型EV71病毒均具有交叉中和效應(yīng)，提示BP2-28是一個(gè)具有一定臨床研究?jī)r(jià)值的交叉中和表位肽，但VP2-28在誘導(dǎo)中和抗體中的作用及機(jī)制仍需進(jìn)一步研究[9-10]。

本文綜合分析三個(gè)多肽在EV71陽(yáng)性患者抗血清中的抗體滴度以及抗血清的中和滴度，發(fā)現(xiàn)EV71的中和抗體水平會(huì)隨著EV71總抗體水平的升高而升高。SP55肽無(wú)論在N端還是C端偶聯(lián)牛血清白蛋白BSA都具體較高的抗體滴度，但SP55肽C端偶聯(lián)BSA的抗體滴度隨著抗血清的中和滴度的升高而升高。SP70肽在人抗血清中的抗體滴度普遍不高，其中N端偶聯(lián)的SP70肽好于C端偶聯(lián)，VP2-28肽N端偶聯(lián)BSA的抗體滴度普遍高于C端偶聯(lián)。三個(gè)多肽中VP2-28和SP55在抗血清中具有更高的抗體滴度：VP2-28肽在抗血清中的抗體滴度最高，由以N末端偶聯(lián)BSA的VP2-28肽的抗體滴度為高。

本文通過(guò)EV71陽(yáng)性患者的抗血清來(lái)初步對(duì)動(dòng)物模型中試驗(yàn)成功的中和表位肽進(jìn)行篩選，去掉抗體滴度低的多肽，從而提高多肽疫苗在人體試驗(yàn)的成功率，降低成本。