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(肇慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，廣東 肇慶 526020)

肺癌為全球最為常見的一種惡性腫瘤，具有較高發(fā)病率與死亡率，其發(fā)病病因主要與吸煙、遺傳、職業(yè)暴露、環(huán)境污染、電離輻射等因素相關(guān)?；颊甙l(fā)病后會(huì)出現(xiàn)胸部脹痛、咯痰、痰血、低熱等癥狀。有相關(guān)研究表示，在肺癌總數(shù)中，非小細(xì)胞肺癌達(dá)到80%左右[1-2]。肺小細(xì)胞肺癌主要有腺癌、鱗癌、大細(xì)胞癌等，與小細(xì)胞肺癌相比，其具有癌細(xì)胞生長(zhǎng)分裂較慢的特點(diǎn)，癌細(xì)胞擴(kuò)散與轉(zhuǎn)移也較晚[3]。非小細(xì)胞肺癌患者常見并發(fā)癥包括胸腔積液、淋巴轉(zhuǎn)移、心包積液等，目前臨床治療非小細(xì)胞肺癌主要采用分期手術(shù)、化療等手段。雖然目前醫(yī)學(xué)相對(duì)較為發(fā)達(dá)，醫(yī)學(xué)技術(shù)不斷進(jìn)步與發(fā)展，但非小細(xì)胞肺癌預(yù)后相對(duì)較差，患者生存率降低。有相關(guān)研究表示，細(xì)胞增殖與及凋亡與腫瘤發(fā)生具有密切的關(guān)系，人體內(nèi)正常細(xì)胞凋亡功能減弱，使得異常細(xì)胞難以被清除，導(dǎo)致基因調(diào)控難以維持平衡，進(jìn)而堆積形成腫瘤[4-5]。因此臨床將誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡作為目前治療非小細(xì)胞肺癌的主要原則。吉西他濱是一種新型抗代謝腫瘤藥物，本研究通過分析吉西他濱體外對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖及凋亡的作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料：資料收集時(shí)間在2014年2月～2016年5月，對(duì)象為人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，由我院呼吸內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行冰凍儲(chǔ)存。細(xì)胞培養(yǎng)：使用RPMI1640 培養(yǎng)液在5%二氧化碳、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，采用0.02%乙二胺四乙酸與0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代，使用比例為1∶1，本次研究所用細(xì)胞均處于指數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2方法：MTT法：使用0.25%胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，接種96孔板，密度為1×104，將無細(xì)胞的培養(yǎng)液作為空白對(duì)照。細(xì)胞貼壁后將不同濃度吉西他濱加入，隨后采用酶聯(lián)免疫儀對(duì)490 nm處的吸光度值進(jìn)行檢測(cè)。

流式細(xì)胞儀：不同濃度藥物對(duì)細(xì)胞處理72 h后行細(xì)胞消化，并將懸浮細(xì)胞進(jìn)行收集，將密度調(diào)整為5×105～1×106個(gè)/ml，將1 ml細(xì)胞離心操作，加入70%乙醇于細(xì)胞內(nèi)，并將置于-20℃低溫固定過夜，采用PBS進(jìn)行清洗2次。隨后加入PI 50 μg/ml與Rnase A 1 mg/ml，于室溫避光條件下進(jìn)行染色處理，半小時(shí)后上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。

Annexin V-PI雙標(biāo)法：將不同濃度藥物對(duì)細(xì)胞處理72 h后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)后使用CELIQUEST軟件對(duì)其凋亡率進(jìn)行分析。bcl-2表達(dá)檢測(cè)：將細(xì)胞在不同吉西他濱濃度下分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，隨后將其制成蓋玻片，進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)本培養(yǎng)，采用配套試劑盒操作后，使用圖像分析儀分析。

2 結(jié)果

2.1吉西他濱體外對(duì)A549細(xì)胞增殖影響：不同濃度吉西他濱對(duì)A549細(xì)胞均有抑制作用，在時(shí)間、劑量上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1。

圖1 吉西他濱體外對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響：縱軸代表抑制率(%)，橫軸代表藥物濃度(μg/ml)

2.2不同濃度吉西他濱體外對(duì)A549細(xì)胞周期影響：藥物濃度增加后，G0/G1使其細(xì)胞比例逐漸升高，S時(shí)期比例逐漸下降，提示藥物濃度對(duì)細(xì)胞周期有顯著影響。見表1。

濃度(μg/ml)G0/G1SG2/M0.00151.7±3.234.5±5.214.6±2.70.0142.5±3.738.7±4.317.9±2.30.141.3±5.149.5±6.111.1±3.7115.9±4.271.8±4.69.1±2.3

2.3細(xì)胞凋亡率分析：經(jīng)Annexin V-PI雙標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果顯示，72 h后不同濃度細(xì)胞凋亡率分別為(4.8±0.3)%、(8.1±0.6)%、(14.9±0.4)%、(31.6±1.2)%，提示吉西他濱濃度增加，細(xì)胞凋亡率為顯著增加。

2.4bcl-2表達(dá)：經(jīng)免疫組化法后，DAB染色后可見各組細(xì)胞漿內(nèi)有棕黃色物質(zhì)，呈顆粒狀，分布深淺不一，將藥物處理前后細(xì)胞棕黃色物質(zhì)平均吸光度進(jìn)行比較，配對(duì)t檢驗(yàn)后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示經(jīng)吉西他濱作用后，bcl-2表達(dá)與細(xì)胞凋亡率有相關(guān)性，呈負(fù)相關(guān)。

3 討論

細(xì)胞凋亡指在細(xì)胞調(diào)控下由基因介導(dǎo)發(fā)生的主動(dòng)自殺現(xiàn)象[6]。細(xì)胞凋亡與調(diào)控基因出現(xiàn)異?？捎行Х从吵鋈梭w內(nèi)腫瘤的生物學(xué)特性。因此誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡成為近年來臨床工作者研究腫瘤的重點(diǎn)。吉西他濱是一種新型胞嘧啶核苷衍生物，進(jìn)入人體后通過脫氧胞嘧啶激酶活化，通過胞嘧啶核苷脫氨酶代謝，是一種抗腫瘤藥物[7-8]。吉西他濱通過在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為磷酸化代謝物，有效發(fā)揮出細(xì)胞毒效果。有相關(guān)研究表示，吉西他濱藥敏性與人體內(nèi)dCK水平有密切相關(guān)性，成正相關(guān)性。吉西他濱進(jìn)入人體后，被體內(nèi)細(xì)胞攝入，會(huì)轉(zhuǎn)化為活性代謝物，如二磷酸酯、三磷酸酯等，可競(jìng)爭(zhēng)性對(duì)DNA鏈延長(zhǎng)進(jìn)行有效抑制，進(jìn)而促使DNA片段形成與細(xì)胞發(fā)生死亡。

有相關(guān)研究結(jié)果表示，吉西他濱在非小細(xì)胞肺癌治療中具有一定效果。但目前臨床對(duì)吉西他濱抑制腫瘤的作用機(jī)制并不清楚，相關(guān)研究也較少。本次研究中分析了吉西他濱對(duì)A549細(xì)胞凋亡增殖、周期、凋亡的影響。結(jié)果顯示不同濃度吉西他濱對(duì)A549細(xì)胞均有抑制作用，在時(shí)間、劑量上均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)出細(xì)胞周期，藥理學(xué)特性主要作用S期。采用Annexin V-PI雙標(biāo)法獲取不同藥物濃度下的凋亡率，隨藥物濃度增加，細(xì)胞凋亡率逐漸升高，提示吉西他濱誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效果顯著。

雖然吉西他濱誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效果顯著，可作為治療非小細(xì)胞肺癌的有效藥物，但大部分細(xì)胞對(duì)藥物存在一定抵抗性，目前臨床對(duì)吉西他濱如何誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制尚不完全明確。筆者認(rèn)為，可通過選擇性激活通道增加藥物療效，有效降低其細(xì)胞耐藥性。有相關(guān)研究表示，吉西他濱可有效促進(jìn)和核濃縮與凋亡通路效應(yīng)Caspase-3激活，對(duì)特定蛋白底物水解進(jìn)行有效抑制，并通過核轉(zhuǎn)錄因子與Akt有效使細(xì)胞凋亡[9-10]。另外有相關(guān)研究表示，吉西他濱誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡與神經(jīng)酰胺途徑相關(guān)，可通過對(duì)神經(jīng)鞘脂循環(huán)進(jìn)行激活，進(jìn)而生成內(nèi)源性神經(jīng)酰胺使其聚集，對(duì)Caspase-3進(jìn)行激活，進(jìn)而誘導(dǎo)Caspase-9與bcl-X發(fā)生剪接變化[11]。由神經(jīng)酰胺介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡可使用Caspase抑制劑進(jìn)行阻滯，也能被bcl-2進(jìn)行抑制。但目前臨床對(duì)bcl-2介導(dǎo)有無參與到吉西他濱誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中尚不清楚，相關(guān)研究較少。本次研究中，通過使用免疫組化染色處理后，將藥物作用前后吸光度值進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)bcl-2表達(dá)呈下調(diào)現(xiàn)象，其與細(xì)胞凋亡率間關(guān)系呈負(fù)相關(guān)。bcl-2表達(dá)下調(diào)可對(duì)Ca2+進(jìn)行阻斷，保持滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣的穩(wěn)定性，進(jìn)而阻止細(xì)胞凋亡出現(xiàn)，此外還可通過對(duì)Caspase-3激活進(jìn)行抑制，將生理性刺激、病理性刺激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程進(jìn)行抑制。

綜上所述，吉西他濱用于非小細(xì)胞肺癌治療中具有一定效果，可有效對(duì)A549細(xì)胞體外增殖進(jìn)行抑制，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，bcl-2參與細(xì)胞凋亡過程中并具有一定作用。但目前其在人體內(nèi)具體機(jī)制尚不清楚，還需進(jìn)行深入研究與分析。