韓 偉，彭茹潔，趙少甫

(1.華東理工大學 藥學院 中藥現(xiàn)代化工程中心，上海 200237;2.上海市新藥設計重點實驗室，上海 200237)

白及(Bletillastriata)是一種多年生草本植物，蘭科白及屬，治療外傷出血效果良好[1]，是傳統(tǒng)的止血藥之一.隨著中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展，白及在醫(yī)藥生產(chǎn)和化妝品行業(yè)發(fā)揮著重要作用.其有效成分白及多糖，又稱白及膠，具有凝血止血、促進造血、抗腫瘤、抗?jié)?、抗氧化、保濕等功效[2]，在藥物研發(fā)與化妝品行業(yè)有著較大的發(fā)展?jié)摿?

目前白及多糖的提取大多采用傳統(tǒng)的水提醇沉法，工藝繁冗復雜，周期長.微波提取[3-4]具有提取效果好、操作周期短、高效環(huán)保、溶劑消耗少等優(yōu)勢，已引起眾多研究者的關注.表面活性劑輔助提取[5-6]也是一種新型提取技術，通過分子中不同部分對水相和油相的親和，降低溶劑與藥材間的界面張力，有利于目標成分的溶出，可提高目標組分的提取率.為了更好地提高白及多糖的提取率，可考慮將表面活性劑與微波提取法聯(lián)用，以達到較佳的提取效果.此外，本實驗在單因素的基礎上運用了Plackett-Burman試驗和響應面分析法優(yōu)化該工藝，避免了在優(yōu)化試驗中由于因子數(shù)太多或部分因素不顯著而造成耗時耗資，是一種高效、經(jīng)濟、快速的實驗設計方法.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

白及藥材，產(chǎn)自云南普洱；硫酸、苯酚，均為分析純；吐溫-80、司盤-80、十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇400，均購自國藥集團試劑有限公司.

UV1900PC型紫外-可見分光光度儀(上海亞研電子公司)；ER-692型改裝的微波提取裝置(中國電子器件工業(yè)總公司).

1.2 分析方法

1.2.1 總多糖的含量測定

最大吸收波長的確定：采用苯酚-硫酸法[7]測定多糖濃度，在400～600 nm波長范圍掃描，確定最佳檢測波長為492 nm.

葡萄糖標準曲線的建立：用移液槍吸取葡萄糖標準品溶液(質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08 mg/mL)2.0 mL于具塞試管中，依次加入1 mL 6%的苯酚溶液、5 mL濃H2SO4，沸水浴30 min，室溫冷卻10 min，于492 nm波長處測定葡萄糖溶液的吸光度.以葡萄糖質(zhì)量濃度C為橫坐標，吸光度值A為縱坐標，得標準曲線方程為A=14.404C-0.017 9，R2=0.999 5.

1.2.2 計算公式

上式中，C為稀釋后的白及樣品溶液中總多糖質(zhì)量濃度(mg/mL)；V為相應待測白及樣品溶液的體積(mL)；n為白及樣品溶液的稀釋倍數(shù)；m為白及藥材的質(zhì)量(g).

1.3 實驗方法

稱取白及粉末1.0 g于錐形瓶中，按一定的液固比加入含有一定濃度表面活性劑的去離子水，微波提取一段時間(微波每輻射加熱20 s，暫停30 s).抽濾，定容于100 mL容量瓶中，以6 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取離心液1 mL，稀釋定容.取稀釋液2 mL于25 mL比色管中，在492 nm處測定相應的吸光度，計算白及總多糖的得率.

1.3.1 單因素試驗設計

分別單獨考察表面活性種類(空白、吐溫-80/T-80、司盤-80/S-80、十二烷基硫酸鈉/SDS、聚乙二醇400/PEG400)、表面活性劑質(zhì)量濃度(1、3、5、7、9、11 g/L)、微波提取時間(60、120、180、240、300、360 s)、液固比(20、30、40、50、60、70 mL/g)、微波功率(72、144、216、288、360、432、504、576、648 W)、pH值(2、4、6、7、8、10)等因素對白及總多糖提取得率的影響.

1.3.2 Plackett-Burman試驗與響應面設計

當工藝優(yōu)化中影響因素較多時，可采用篩選試驗——Plackett-Burman試驗[8]，通過分析比較各因素效應值及其顯著性篩選出有顯著影響的因素.本文以白及多糖得率為指標，采用響應面設計法對實驗條件進行優(yōu)化[9].

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 表面活性劑的篩選

圖1為在表面活性劑質(zhì)量濃度4 g/L、微波時間60 s、液固比30 mL/g、微波功率648 W、pH為7的實驗條件下不同表面活性劑協(xié)同微波法提取白及多糖的實驗結(jié)果，由圖1可知聚乙二醇400(PEG400)提取效果最好.由于微波的熱效應會產(chǎn)生大量的熱量，能迅速提升提取液的溫度，可能破壞某些表面活性劑的結(jié)構及性能，而聚乙二醇400作為有較高要求的熱載體，在高溫下仍能保持原有的結(jié)構和性能[5]，因此本文選擇聚乙二醇400為表面活性劑.

圖1 表面活性劑種類對白及總多糖得率的影響

圖2 PEG400質(zhì)量濃度對白及總多糖得率的影響

2.1.2 PEG400質(zhì)量濃度

一般而言，表面活性劑濃度增大，其增溶和潤濕作用的效果將增強，從而使細胞組織中目標成分的溶出率增加.圖2為在微波時間60 s、液固比30 mL/g、功率648 W、pH為7實驗條件下PEG400質(zhì)量濃度對白及總多糖得率的影響結(jié)果，可以看出多糖得率隨PEG400質(zhì)量濃度的增大顯著上升，當質(zhì)量濃度在5～9 g/L范圍內(nèi)得率基本保持不變；當質(zhì)量濃度超過9 g/L，得率呈下降趨勢.這可能是因為當表面活性劑濃度超過臨界值時，增溶和潤濕作用已經(jīng)趨于飽和，隨著濃度的進一步增大，部分膠束被藥材組織細胞所吸附，從而導致多糖得率有所下降.因此，選取PEG400質(zhì)量濃度為5 g/L.

2.1.3 微波提取時間

圖3為在PEG400質(zhì)量濃度5 g/L、液固比30 mL/g、微波功率648 W、pH為7實驗條件下微波提取時間對白及多糖得率的影響.可知：當微波輻射時間在60～240 s范圍時，多糖得率隨提取時間的延長而增大；當時間超過240 s，得率有所下降.究其原因可能是隨著微波輻射時間的延長，微波能增加，使得藥材破碎越充分，進而越容易釋放出細胞內(nèi)的多糖類物質(zhì).但當輻射時間過長時，高溫會導致部分多糖被破壞，得率反而下降.綜上，選取微波提取時間為240 s.

2.1.4 液固比

一般而言，液固比與傳質(zhì)推動力相關，將直接影響提取效率.圖4為在PEG400質(zhì)量濃度5 g/L、微波時間240 s、功率功率648 W、pH為7實驗條件下液固比對白及總多糖得率的影響結(jié)果，在液固比為20～60 mL/g的范圍內(nèi)，隨著液固比的增大，溶劑與藥材細胞間的傳質(zhì)推動力增加，進而加快了目標物質(zhì)的溶出和擴散.當液固比進一步增大時，單位體積微波能的熱效應減小，多糖溶出量減少.綜合考慮，確定微波提取工藝中的液固比為60 mL/g.

圖3 微波提取時間對白及總多糖得率的影響

圖4 液固比對白及總多糖得率的影響

2.1.5 微波功率

圖5 微波功率對白及總多糖得率的影響

微波輻射條件主要涉及微波功率，本實驗微波設備的功率分為9檔，分別為72、144、216、288、360、432、504、576、648 W.圖5為在PEG400質(zhì)量濃度5 g/L、微波時間240 s、液固比60 mL/g、pH為7實驗條件下微波功率對白及總多糖得率的影響，由圖可知，多糖得率隨功率的提高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在576 W(第8檔)達到最大值為31.77%.這主要是因為在通常情況下隨著微波功率的增大，微波能的熱效應也隨之增加，多糖溶出加快；但當微波功率進一步增大時，微波能過大，可能導致多糖的化學結(jié)構和性質(zhì)發(fā)生變化，使得最終總多糖得率下降.綜上，選取微波功率為576 W.

2.1.6 pH值

圖6 pH值對白及總多糖得率的影響

pH值對白及總多糖得率的影響結(jié)果如圖6所示.由圖可知，在PEG400協(xié)同微波提取白及多糖的工藝中，當溶液為中性時，白及多糖得率達到最大值.由于PEG400為非離子型表面活性劑，pH值對其影響不明顯；白及中性多糖可能含量較多，因此當提取液過酸或者過堿時，不利于中性多糖的溶出.這里溶液的pH值控制在7左右為宜.

2.2 Plackett-Burman試驗

根據(jù)上述單因素實驗，對PEG400質(zhì)量濃度、微波時間、液固比、微波功率以及pH值等5個因素的最優(yōu)提取條件分別取高、低兩個水平，Plackett-Burman試驗設計因素和水平見表1.

表1 Plackett-Burman設計的因素和水平

按照Plackett-Burman試驗設計，在不同的提取條件下進行實驗，結(jié)果如表2.

表2 Plackett-Burman實驗設計及結(jié)果

以白及多糖得率為考察指標，用Design expert 8.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理.分析各因素的顯著性(如表3)，由于模型的P<0.05，可知該模型具有顯著影響性.5個因子影響大小排序為微波功率>液固比>微波時間> pH值> PEG400質(zhì)量濃度.其中液固比、微波功率和微波時間對微波提取具有顯著性影響.

表3 各因素效應值及其顯著性分析

2.3 響應面設計優(yōu)化

根據(jù)上述Plackett-Burman試驗結(jié)果，擇選出微波時間、液固比和微波功率3個顯著性因素，設計三因素三水平Box-Behnken響應面試驗[9]，試驗因素及水平見表4，實驗結(jié)果及預測值見表5.

表4 響應面分析因素和水平

表5 響應面試驗設計結(jié)果

表6 回歸方程模型系數(shù)評估及其顯著性檢驗

通過Design Expert 軟件可得微波時間(X1)、液固比(X2)和微波功率(X3)3種因子兩兩交互作用對微波提取白及多糖得率影響的響應面和等值線圖(見圖7～圖9).

圖7 Y=F(X1,X2)的響應面圖與等值線圖

圖8 Y=F(X1,X3)的響應面圖與等值線圖

圖9 Y=F(X2,X3)的響應面圖與等值線圖

根據(jù)上述響應面設計試驗分析，確定微波提取的最佳工藝條件：微波提取時間為300 s，液固比為62.91∶1，微波功率為529.90 W，白及總多糖得率為32.74%.由于本實驗中微波裝置各檔的功率是固定的，考慮到實際操作的可行性，因此將理論工藝參數(shù)調(diào)整為：微波提取時間300 s，液固比63∶1，微波功率504 W(第7檔)，PEG400質(zhì)量濃度5 g/L，溶液pH 7，此時白及總多糖實際得率為(32.48±0.18)%.

3 結(jié)論

本文采用表面活性劑協(xié)同微波法進行白及多糖的提取，通過單因素考察結(jié)合Plackett-Burman試驗和響應面分析法優(yōu)化工藝參數(shù)，得到白及多糖的最佳提取條件為：PEG400質(zhì)量濃度5 g/L，溶液pH 7，微波提取時間為300 s，液固比為63 mL/g，微波功率為504 W.在此優(yōu)化工藝下，白及多糖的得率為(32.48±0.18)%.