鄭興,吳兆紅,黃達(dá)德,陳敏東,謝建將,白文杰

(1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院,廣州510150;2廣州市第一人民醫(yī)院)

心臟移植是心臟衰竭最有效的治療方法之一，供心心肌保護(hù)是手術(shù)成功的關(guān)鍵也是當(dāng)前研究熱點(diǎn)?？萍歼M(jìn)步為供心保護(hù)提供了多種方法，1987年Grobben等[1]開始用含氧或含血停搏液保護(hù)供心細(xì)胞。Eltzschig等[2]提出遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理概念并用以保護(hù)靶器官缺血再灌注損傷。2005年歐美多家心臟中心開展供心不停跳保存保護(hù)移植供心。眾多供心保護(hù)方法中，藥物預(yù)處理可控性和安全性較高。許多研究發(fā)現(xiàn)藥物預(yù)處理在抗心肌缺血再灌注損傷方面有良好效果，具有良好臨床應(yīng)用前景。已經(jīng)證實(shí)預(yù)處理對(duì)移植供心有保護(hù)作用的藥物有單磷酰酯A、三磷酸腺苷敏感性鉀通道開放劑(KATPCOs)、吸入性麻藥和阿片類麻醉藥、腺苷等。地奧司明具有清除自由基、抗脂質(zhì)及舒張血管作用[3，4]，其預(yù)處理已被證實(shí)對(duì)腎、腦等器官缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，但未見對(duì)心臟移植中供心保護(hù)作用的報(bào)道。2016年1～12月，我們以新西蘭白兔為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，建立對(duì)照組、地奧司明預(yù)處理組和地奧司明加超氧化物歧化酶(SOD)抑制劑二乙基二硫代氨基甲酸鈉(DDTC)預(yù)處理組，對(duì)比各組心肌酶、凋亡指數(shù)、心肌組織含水量，并觀察鏡下心肌組織，探討地奧司明預(yù)處理對(duì)移植供心的保護(hù)作用及其機(jī)制，為地奧司明預(yù)處理的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 成年健康新西蘭白兔36只，雌雄不限，體質(zhì)量(2.5±0.5)kg，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，在廣州市第一人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心統(tǒng)一飼養(yǎng)。主要試劑和儀器： DDTC溶液(西格瑪奧德里奇公司，按1 g DDTC溶于10 mL生理鹽水配制)，TUNEL試劑盒(promega公司)，起搏器(5348型，美國Medtronic)，血?dú)夥治鰞x(i-stati型，美國Abbott)，光學(xué)顯微鏡(CX41，日本Olympus)，小動(dòng)物呼吸機(jī)(江西特力公司)，除顫及心電監(jiān)護(hù)儀(LD-9型，美國PHYSIO-CONTROL)，生物組織石蠟包埋機(jī)(武漢俊杰電子公司)，組織切片機(jī)(Shandon)，圖像分析系統(tǒng)(重慶天海醫(yī)療設(shè)備有限公司)，自動(dòng)生化分析儀(Cobas 6000，美國羅氏)，磷酸肌酸同工酶MB檢測(cè)試劑盒、高敏肌鈣蛋白T檢測(cè)試劑盒、肌紅蛋白檢測(cè)試劑盒(美國羅氏)。

1.2 供心摘取 供體兔稱重，腹腔注射50 mg/kg苯巴比妥鈉,麻醉成功后，行氣管切開插管，插管深度3 cm，接小動(dòng)物呼吸機(jī)(參數(shù)設(shè)置：容量控制、氧濃度40%～50%、潮氣量8 ml/kg、呼吸頻率23次/min)。正中開胸，游離心臟大血管，右房全身肝素化(400 U/kg),阻斷主動(dòng)脈并灌注改良Stanford停搏液(15 mL/kg，4 ℃),灌注完畢后取心，結(jié)扎修剪心臟血管，置于改良Stanford停搏液中(4 ℃)保存2 h。

1.3 分組及處理 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)抽樣分為對(duì)照組、地奧司明預(yù)處理組、地奧司明+DDCT預(yù)處理組，每組12只。各組內(nèi)再次隨機(jī)抽樣分為6亞組，組內(nèi)隨機(jī)分配抽出供體、受體。分組結(jié)果：對(duì)照組(n=12，供體、受體各6只)；地奧司明預(yù)處理組(n=12，供體、受體各6只)；地奧司明+DDTC預(yù)處理組(n=12，供體、受體各6只)。對(duì)照組正常飲食。地奧司明預(yù)處理組在實(shí)驗(yàn)開始前10 d予以地奧司明(80 mg/kg)灌胃，2次/d。地奧司明+DDCT預(yù)處理組在實(shí)驗(yàn)開始前10 d予以地奧司明(80 mg/kg)灌胃，2次/d，并在行同種異位心移植前15 min，于兔耳緣靜注射DDTC(300 mg/kg)。受體麻醉、氣管插管同供體。建立耳緣靜脈補(bǔ)液通道，耳緣靜脈采血2 mL送檢。然后行改良Ono’s異位心移植術(shù)(股動(dòng)靜脈處行同種異位心臟移植術(shù))。具體操作：受體右側(cè)腹股溝中點(diǎn)做長4 cm切口，顯露并游離股動(dòng)、靜脈；修剪醫(yī)用輸液管道(保留轉(zhuǎn)換接頭部分)，管道段分別插入并結(jié)扎固定于已修剪完成的供心主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈端；留置針(BD公司，24 G)插入受體股動(dòng)、靜脈，并用7號(hào)線打結(jié)固定；取出供心并充分?jǐn)D壓供心排盡左心室氣體，開放股動(dòng)脈血管鉗，將主動(dòng)脈轉(zhuǎn)換接頭與股動(dòng)脈留置針銜接，并旋轉(zhuǎn)固定，肺動(dòng)脈轉(zhuǎn)換接頭與股靜脈留置針銜接并旋轉(zhuǎn)固定。心臟復(fù)跳30、60、90 min于耳緣靜脈通道處采血2 mL送檢，心臟復(fù)跳2 h后取下供心結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

1.4 心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立刻在移植供心左心室縱軸取厚約2 mm的心肌組織，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋、切片、脫蠟至水、染色、脫水及透明處理、封片后，光鏡下觀察供心心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)。同樣取材方式取心肌組織標(biāo)本，立刻置于4 ℃、2.5%戊二醛中進(jìn)行固定操作，然后50%～100%乙醇多級(jí)脫水，后用環(huán)氧樹脂進(jìn)行包埋，超薄切片和醋酸鈾染色，透射電鏡觀察。

1.5 心肌酶指標(biāo)的檢測(cè) 受體新西蘭兔移植前，移植后30、60、90 min，分別于耳緣靜脈補(bǔ)液通路采靜脈血2 mL，低溫保存，2 h內(nèi)使用本院全自動(dòng)血液生化儀測(cè)定肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白I(cTnI)、肌紅蛋白(MYO)。

1.6 供心左室心肌組織含水量檢測(cè) 供心移植并成功復(fù)跳后2 h，取下供心，在供心左心室心尖部用眼科剪剪取部分心肌組織，試紙拭干心肌組織標(biāo)本表面水分，稱取心肌組織標(biāo)本濕重并記錄。然后將心肌組織標(biāo)本放置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱里，65 ℃恒溫干燥24 h，最后稱取心肌組織標(biāo)本干重并記錄。按心肌組織含水量計(jì)算公式[含水量=(心肌組織濕質(zhì)量-干質(zhì)量)÷心肌組織濕質(zhì)量×100%]計(jì)算心肌組織含水量。

1.7 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)檢測(cè) 用光學(xué)顯微鏡觀察標(biāo)本。細(xì)胞核中存在褐色顆粒物的為凋亡心肌細(xì)胞。每份標(biāo)本觀察3張切片，每個(gè)切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)，在400倍顯光學(xué)微鏡下計(jì)算標(biāo)本切片的凋亡心肌細(xì)胞和正常心肌細(xì)胞個(gè)數(shù)。AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 各組肉眼觀察結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行移植手術(shù)19例，失敗1例，改良Ono’s模型建立成功率94.74%，移植吻合用時(shí)(5±2)min。失敗實(shí)驗(yàn)受體尸體解剖可見氣管黏膜大片斑片樣出血灶，考慮致死原因?yàn)楹粑莱鲅饸獾拦Ｗ?。移植供心自?dòng)復(fù)跳，竇性心律，心率110～150次/min，收縮力良好。供心肉眼觀察：地奧司明預(yù)處理組較對(duì)照組、地奧司明+DDCT預(yù)處理組心肌收縮更有力，節(jié)律更好，心肌更紅潤；對(duì)照組和地奧司明+DDCT預(yù)處理組無明顯區(qū)別。移植供心心功能復(fù)灌后半小時(shí)達(dá)最佳，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，心功能均有不同程度下降，具體表現(xiàn)為心臟收縮乏力和心律不齊，其中對(duì)照組和地奧司明+DDCT預(yù)處理組尤為明顯。

2.2 各組心肌酶比較 移植前各組基礎(chǔ)心肌酶指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。復(fù)跳后30、60、90 min三組心肌酶指標(biāo)均升高。地奧司明預(yù)處理組心肌酶指標(biāo)升高幅度均低于另外兩組(P均<0.05)；地奧司明+DDTC預(yù)處理組心肌酶指標(biāo)升高幅度低于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

2.3 三組左室心肌組織含水量比較 對(duì)照組、地奧司明預(yù)處理組、地奧司明預(yù)處理+DDCT組左室心肌組織含水量分別為80.8%±1.1%、72.7%±1.5%、79.7%±1.1%，地奧司明預(yù)處理組較對(duì)照組和地奧司明預(yù)處理+DDCT組低(P均<0.01)。地奧司明預(yù)處理+DDCT組與對(duì)照組比較，P>0.05。

2.4 三組鏡下表現(xiàn) ①光鏡下觀察：地奧司明預(yù)處理組：心肌細(xì)胞染色良好，形態(tài)接近正常，排列規(guī)則有序，心肌纖維豐富，間隙和結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞核藍(lán)染、大小形態(tài)近正常，胞質(zhì)呈淡紅染，形態(tài)飽滿。地奧司明+DDTC預(yù)處理組：心肌細(xì)胞排列欠規(guī)則，結(jié)構(gòu)欠清晰，心肌細(xì)胞稍顯肥大，橫紋結(jié)構(gòu)欠清晰，心肌纖維結(jié)構(gòu)稍紊亂、間隙擴(kuò)大，纖維淡染模糊，心肌間質(zhì)出現(xiàn)水腫，部分心肌細(xì)胞出現(xiàn)變性和不同程度壞死，細(xì)胞核溶解、固縮和消失。對(duì)照組：心肌細(xì)胞普遍呈變性和壞死，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和排列秩序紊亂，細(xì)胞間隙增大且界限模糊，大部分細(xì)胞核固縮，個(gè)別溶解、消失，胞質(zhì)溶解呈空泡氣球樣變或網(wǎng)狀改變。②電鏡下觀察：地奧司明預(yù)處理組：心肌細(xì)胞核大致呈三種形態(tài)：梭形、橢圓形、長桿狀，核膜清晰可見，常染色體為細(xì)顆粒狀，異染色體分布在核膜內(nèi)側(cè)，肌纖維排列未見紊亂，閏盤、Z帶清晰可見，肌原纖維間有桿狀線粒體和糖原顆粒。線粒體排列均勻，線粒體脊和膜清晰可見，L小管存在兩側(cè)肌漿網(wǎng)；地奧司明+DDTC預(yù)處理組：細(xì)胞核不規(guī)則形，核膜尚且清晰，肌纖維排列接近正常，閏盤、Z帶較模糊，線粒體輕微腫脹，部分出現(xiàn)嵴溶解，糖原顆粒減少；對(duì)照組：細(xì)胞核呈不規(guī)則形，肌纖維排列紊亂，閏盤、Z帶模糊，線粒體較腫脹，嵴溶解，糖原顆粒顯著減少。

表1 三組不同時(shí)間cTnI、CK-MB、肌紅蛋白比較

2.5 三組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 對(duì)照組、地奧司明預(yù)處理組、地奧司明預(yù)處理+DDCT組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為21.6%±1.3%、7.1%±0.9%、20.3%±1.4%。地奧司明預(yù)處理組較對(duì)照組和地奧司明預(yù)處理+DDCT組低(P均<0.01)；地奧司明+DDCT預(yù)處理組凋亡指數(shù)雖然較對(duì)照組低，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

嚙齒類動(dòng)物異位心臟模型[5]是研究心臟移植的最佳模型并且應(yīng)用廣泛。Yildiz等[6]利用小鼠成功進(jìn)行腹腔異位心移植術(shù)(Ono’s術(shù)式)，Steurer等[7]用頸部動(dòng)靜脈完成了小鼠同種異位心移植。腹腔異位心移植模型吻合成功率高、移植供心血供充足，但相對(duì)頸部異位心移植模型而言，腹腔異位心移植模型創(chuàng)傷更大、對(duì)受體內(nèi)環(huán)境影響更顯著且移植供心觀察不方便。我們?cè)贠no’s術(shù)式基礎(chǔ)上對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行改良，將移植位置從腹腔動(dòng)靜脈改至股動(dòng)靜脈，使用動(dòng)脈留置針套管插管吻合術(shù)式，減少受體創(chuàng)傷同時(shí)保證供心的吻合成功率和血運(yùn)。改良Ono’s心臟移植模型具有手術(shù)操作簡便，用時(shí)短，成功率高，創(chuàng)傷小，對(duì)動(dòng)物生理影響小等優(yōu)點(diǎn)，是最適合研究心臟移植的模型之一，尤其適用于吻合技術(shù)不成熟、樣本量大的實(shí)驗(yàn)。本研究采用改良Ono’s心臟移植模型實(shí)驗(yàn)方法，設(shè)立對(duì)照組、地奧司明預(yù)處組、地奧司明+DDCT預(yù)處理組，對(duì)心臟移植后各組間心肌酶、凋亡指數(shù)、心肌含水量、心肌組織進(jìn)行對(duì)比分析，進(jìn)行地奧司明預(yù)處理對(duì)移植供心的保護(hù)作用及保護(hù)機(jī)理的研究。

地奧司明為天然黃酮類衍生物，具有促進(jìn)靜脈回流和保護(hù)血管作用，主要用于痔瘡及慢性靜脈功能不全疾病治療。近年研究發(fā)現(xiàn)，地奧司明預(yù)處理具有減少細(xì)胞凋亡、抑制炎癥反應(yīng)、降低氧化應(yīng)激反應(yīng)、增高SOD活性等作用[8～10]，對(duì)減輕器官缺血再灌注損傷有明確作用。Xiong等[11]研究發(fā)現(xiàn)，地奧司明預(yù)處理可抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，減輕大鼠腦缺血再灌注損傷。袁銘等[12]發(fā)現(xiàn)，地奧司明預(yù)處理可提高大鼠體內(nèi)SOD活性，減輕腎臟缺血再灌注損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，地奧司明預(yù)處理能減輕移植供心心肌水腫和凋亡壞死，并降低移植后受體心肌酶指標(biāo)，表明地奧司明預(yù)處理對(duì)移植供心有保護(hù)作用。為探明地奧司明對(duì)移植供心保護(hù)作用機(jī)制，我們建立地奧司明+DDCT預(yù)處理組，在供心移植前15 min于受體耳緣靜脈注射SOD抑制劑DDTC，實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出地奧司明+DDCT預(yù)處理組移植供心心肌含水量、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)和移植后受體心肌酶指標(biāo)較地奧司明預(yù)處理組高，與對(duì)照組相比并無明顯差異，表明地奧司明預(yù)處理通過提高機(jī)體抗氧自由基作用達(dá)到減輕心肌細(xì)胞損傷目的，起保護(hù)心肌作用。

我們通過實(shí)驗(yàn)，一方面，證實(shí)了在抗心肌缺血再灌注損傷方面地奧司明預(yù)處理有較好效果，主要通過提高體內(nèi)SOD活性來實(shí)現(xiàn)，與學(xué)者們?cè)缙谘芯拷Y(jié)果相符合；另一方面，擴(kuò)大了預(yù)處理使用的選擇范圍,并為藥物預(yù)處理在臨床應(yīng)用奠定動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但是，實(shí)驗(yàn)樣本含量較小是本實(shí)驗(yàn)不足之處，接下來我們將進(jìn)行更大樣本實(shí)驗(yàn)研究來驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了改良Ono’s心臟移植模型有效、成功率高，可廣泛應(yīng)用于動(dòng)物心臟移植實(shí)驗(yàn)中。地奧司明預(yù)處理能降低心臟移植中心肌缺血再灌注損傷，主要是通過提高機(jī)體抗氧化作用實(shí)現(xiàn)，在臨床應(yīng)用中具有廣泛前景。