來(lái)蕾,崔永新,蘇獻(xiàn)雙,夏應(yīng)鋒,來(lái)慶國(guó),李新,林桂梅

(1山東大學(xué)第二醫(yī)院，濟(jì)南250033;2 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院;3山東大學(xué)藥學(xué)院 )

骨缺損修復(fù)重建和骨折愈合的研究一直備受口腔頜面外科醫(yī)生關(guān)注，因此，尋找一種簡(jiǎn)單、方便和安全的促進(jìn)新骨形成方法一直是很多學(xué)者關(guān)心和研究的熱點(diǎn)。牽張成骨術(shù)是通過(guò)持續(xù)的牽張力延長(zhǎng)骨骼的外科手術(shù)，此技術(shù)最初被應(yīng)用于矯形外科領(lǐng)域治療短腿畸形，其后成功引入口腔頜面外科并廣泛應(yīng)用于常規(guī)手術(shù)難以治療的各種顱頜面缺損畸形治療[1]。但牽張成骨也存在著某些局限性如牽張速度受限、治療周期相對(duì)較長(zhǎng)、牽張過(guò)快過(guò)長(zhǎng)時(shí)會(huì)導(dǎo)致新骨形成不良等問(wèn)題。有很多方法都被嘗試用于促進(jìn)牽張成骨，主要包括細(xì)胞因子的局部應(yīng)用、干細(xì)胞治療、基因治療和物理療法等[2]。有研究表明，生長(zhǎng)激素(GH)促進(jìn)成骨功能十分強(qiáng)大，對(duì)骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。研究證明，通過(guò)皮下注射全身應(yīng)用外源性GH能促進(jìn)牽張成骨新骨形成和礦化[3，4]，這與以往研究中需要在牽張間隙多點(diǎn)注射相比較，具有使用方便，操作過(guò)程簡(jiǎn)單快捷，劑量可控性強(qiáng)，藥劑來(lái)源廣泛等優(yōu)點(diǎn)。一直以來(lái)，凝膠材料在藥劑學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注，研發(fā)者根據(jù)臨床需要不斷地創(chuàng)新，目前臨床上常用的植入釋藥的溫敏凝膠有異丙基丙烯酰胺共聚物、嵌段聚合物以及多糖/鹽體系三種[5,6]。溫敏凝膠屬于智能型凝膠的一種，具有對(duì)環(huán)境溫度變化敏感的特點(diǎn)，當(dāng)處于溶膠狀態(tài)時(shí)可以根據(jù)需要隨意添加不同性質(zhì)的藥物[7]，以溶液形式給藥以后，在周圍環(huán)境溫度升高后即發(fā)生溶膠-凝膠的相轉(zhuǎn)變，從而實(shí)現(xiàn)了藥物緩慢釋放且長(zhǎng)效的目的。2017年1～12月，本課題組探討了以磷脂酰乙醇胺(PE)、膽固醇，油酸制備GH脂質(zhì)體，并將制備的脂質(zhì)體負(fù)載到溫敏凝膠中的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料 主要試劑：GH(海濟(jì)生物技術(shù)有限公司),大豆磷脂 (北京奧博星生物技術(shù)有限公司),磷酸氫二鈉(天津博迪化工股份有限公司),考馬斯亮藍(lán)(國(guó)藥集團(tuán)化藥試劑有限公司),膽固醇(濟(jì)南岱罡生物技術(shù)有限公司),乳酸-乙醇酸(PLGA)-聚乙醇(PEG)-PLGA(濟(jì)南岱罡生物技術(shù)有限公司)。主要儀器：EL204電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，N-1001型EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛郎儀器有限公司)，JEM-100CXⅡ型透射電子顯微鏡(日本電子公司)，DelsaTM Nano系列Zeta電位和粒徑測(cè)定儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司)，透析袋(截留分子量8 000)(北京索萊寶科技有限公司)，UV-2102PCS紫外分光光度計(jì)(上海尤尼柯儀器有限公司)。

1.2 GH含量的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法。精密稱量GH 3.2 mg，充分溶解于磷酸鹽緩沖液(PBS)，并稀釋為1.6 mg/mL儲(chǔ)備液。取PBS 200 μL與馬斯亮藍(lán)溶液900 μL考充分混合，渦旋10 s，在400～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描,以其為空白溶液，取GH溶液200 μL經(jīng)同樣方法處理，在610 nm處有最大吸收。因此確定GH的檢測(cè)波長(zhǎng)為610 nm。標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：精密量取GH儲(chǔ)備液，稀釋成5、10、20、30、50、70、100 μg/mL系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以所選溶劑為空白，于選定吸收波長(zhǎng)610 nm處測(cè)定吸光度值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定線性范圍。精密度實(shí)驗(yàn)：將低中高(10、30、70 μg/mL)三個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液放置于室溫下，于610 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。分別于一天內(nèi)測(cè)定5次，求得日內(nèi)精密度。回收率實(shí)驗(yàn)：稱取GH適量，加入PBS(pH 7.4)溶解，定容后制成濃度分別為10.0、30.0、70.0 μg/mL的低、中、高三水平溶液，各3份。于610 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3 負(fù)載GH脂質(zhì)體的制備 精密稱取磷脂與GH以6∶1比例溶解于氯仿，加入一定體積的緩沖液，探頭超聲9 s，形成o/w相，在35 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)有機(jī)溶劑，在45 ℃下水化45 min。量取脂質(zhì)體混懸液1 mL，10 000 r/min離心10 min，取200 μL加入考馬斯亮藍(lán)溶液900 μL，在610 nm處測(cè)定吸收度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量，此含量為游離藥物?？偹幜恳钥偼端幜繛闇?zhǔn)。包封率=總藥量-游離藥物/總藥量×100%。

1.4 負(fù)載GH脂質(zhì)體的鑒定 藥脂比的影響：分別精密量取磷脂酰膽堿儲(chǔ)備液900 μL (10 mg/mL),800 μL,480 μL,240 μL，總膽固醇儲(chǔ)備液(5 mg/mL)與磷脂酰膽堿的質(zhì)量比保持3∶1，加入氯仿至3 mL中，加入1.6 mg/mL GH 1mL，使磷脂與藥物的比值分別為6∶1、5∶1、3∶1、3∶2，置于超聲儀中18 s，將混合物置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中去除有機(jī)溶劑，在55 ℃的PBS中水化30 min。超聲時(shí)間：精密量取磷脂酰膽堿儲(chǔ)備液900 μL(10 mg/mL)，總膽固醇儲(chǔ)備液600 μL(5 mg/mL)，加入氯仿至3 mL中，加入1.6 mg/mL GH1 mL，置于超聲儀中9、18、36 s，將混合物置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中去除有機(jī)溶劑，在55 ℃的PBS中水化30 min。水化溫度：分別在30 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃的PBS中水化30 min。水化時(shí)間：分別在55℃的PBS中水化30、45、60 min。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：通過(guò)單因素的考察，將獲得最高包封率的因素進(jìn)行組合。精密量取磷脂酰膽堿儲(chǔ)備液900 μL(10 mg/mL)，總膽固醇儲(chǔ)備液600 μL(5 mg/mL)，加入氯仿至3 mL中，加入1.6 mg/mL GH1 mL，置于超聲儀中9 s，將混合物置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中去除有機(jī)溶劑，在45 ℃的PBS中水化45 min。利用動(dòng)態(tài)光散射原理，對(duì)脂質(zhì)體的粒徑和分布進(jìn)行測(cè)定。檢測(cè)Zeta電勢(shì)。

1.5 含有GH脂質(zhì)體凝膠的制備 首先選用試管倒置法檢測(cè)本凝膠相轉(zhuǎn)變溫度。配制一系列不同濃度三嵌段共聚物PLGA-PEG-PLGA聚合物溶液(10%、15%、20%、25%、30%、w/w ),取2 mL置于具塞試管中,并把試管放進(jìn)水浴中，使水的液面高于聚合物溶液，水浴從15 ℃開始緩慢升溫，每隔0.5 ℃將試管傾斜180°以便觀察溶液的流動(dòng)情況。溶液不流動(dòng)時(shí)的溫度即凝膠溫度。每個(gè)樣品測(cè)定3次，取其均值。精密稱取PLGA-PEG-PLGA聚合物適量置于燒杯中，在攪拌下加入定量的蒸餾水，繼續(xù)攪拌直至聚合物均勻分散，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存使凝膠充分溶脹、溶解即可得到無(wú)色透明的PLGA-PEG-PLGA聚合物凝膠溶液。將一定量的負(fù)載GH脂質(zhì)體在攪拌下緩慢加入溶脹完全的空白聚合物凝膠PLGA-PEG-PLGA溶液中，繼續(xù)攪拌均勻即得含有藥物的凝膠。

1.6 GH脂質(zhì)體凝膠體外釋放度的測(cè)定 采用無(wú)膜擴(kuò)散法測(cè)定。藥物從凝膠中的釋放，對(duì)比游離藥物凝膠和負(fù)載藥物脂質(zhì)體凝膠在PBS中的釋放度。將1.0 mL游離藥物和載有藥物的脂質(zhì)體在攪拌下分別緩慢加入到溶脹完全的空白聚合物凝膠PLGA-PEG-PLGA溶液中，37 ℃下形成凝膠，加入PBS (pH 7.4) 10 mL，隨后將裝有凝膠的試管放置于恒溫振蕩儀中，將溫度控制在(37±0.5)℃,轉(zhuǎn)速為100 r/min。整個(gè)溶出的過(guò)程將試管密封。在30 min，1、2、4、6、8、10、12 h等設(shè)定的取樣時(shí)間點(diǎn)取樣，取樣量為1.0 mL，同時(shí)補(bǔ)充恒溫的新鮮PBS介質(zhì)1.0 mL，樣品經(jīng)處理后于610 nm用UV測(cè)定，計(jì)算累積釋放度。

2 結(jié)果

2.1 GH脂質(zhì)體制備方法的有效性 依據(jù)考察單因素得出的處方為將磷脂與GH以6∶1比例配比，探頭超聲9 s，形成o/w相，在35 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)有機(jī)溶劑，在45 ℃下水化45 min。為驗(yàn)證該處方具有較高的包封率和方法的重現(xiàn)性，制備脂質(zhì)體5份，算出包封率和載藥量，5份脂質(zhì)體的包封率分別為96.22%、97.88%、97.88%、96.22%、96.93%，載藥量分別為11.3%、11.54%、11.54%、11.37%、11.44%。通過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，制備的脂質(zhì)體包封率和載藥量均較高，包封率和載藥量的變化并不大，方法具有較好的重現(xiàn)性。脂質(zhì)體主要分布在567 nm左右，具有較好的分散度(PdI=0.326)，Zeta電勢(shì)在-15.48 mV。

2.2 聚合物溶液相轉(zhuǎn)變溫度 通過(guò)制備一系列濃度的PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物溶液，測(cè)定其轉(zhuǎn)變成凝膠的溫度。10%、15%、20%、25%、30%濃度的聚合物相轉(zhuǎn)變溫度分別為34.0 ℃ 、34.5 ℃、32.5 ℃、32.5 ℃、31 ℃。隨著濃度的增加，相轉(zhuǎn)變溫度逐漸降低。當(dāng)質(zhì)量濃度低于10%時(shí)，在37 ℃不能形成凝膠，不具有繼續(xù)研究的價(jià)值。質(zhì)量比為30%或高于30%時(shí)聚合物的水溶液較黏稠，一定程度上會(huì)影響通針性，最終選擇15%為制備凝膠的濃度，向其中加入不同量的脂質(zhì)體或游離藥物。其溶液-凝膠相轉(zhuǎn)變溫度為34.5 ℃，且通針性較好，溶液狀態(tài)澄清透明。

2.3 GH脂質(zhì)體凝膠體外釋放度 對(duì)比游離藥物凝膠和負(fù)載藥物脂質(zhì)體凝膠在緩沖溶液中的釋放度發(fā)現(xiàn)，藥物具有透過(guò)PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)釋放的作用，從30 min開始釋放，24 h的累積釋放度到47.28%。見圖1。GH脂質(zhì)體凝膠的釋放曲線表明，藥物在8 h達(dá)到最大值。見圖2。

圖1 游離藥物凝膠的釋放曲線

圖2 負(fù)載GH脂質(zhì)體凝膠的釋放曲線

3 討論

牽張成骨術(shù)是目前國(guó)內(nèi)外口腔頜面外科領(lǐng)域研究較多的一種新型技術(shù)，牽張成骨的基礎(chǔ)是在牽張間隙內(nèi)能產(chǎn)生并形成形態(tài)和質(zhì)地均較好的新的骨組織。有研究[8]表明，牽張成骨在新骨生成的同時(shí)也會(huì)有胚胎的發(fā)育、新生兒骨生長(zhǎng)以及骨折愈合等方面的生物學(xué)特征。但由于牽張成骨的治療時(shí)間較長(zhǎng)和可能存在骨再生不良等問(wèn)題以及患者本身骨質(zhì)不良時(shí)都影響了該技術(shù)的治療效果。因此，目前尋找促進(jìn)新骨形成的方法已成為很多學(xué)者們研究的熱點(diǎn)。在我們前期的研究中發(fā)現(xiàn)，骨牽張部位在創(chuàng)傷和牽張力的作用下，局部存在低氧和缺血的情況，細(xì)胞間質(zhì)液會(huì)出現(xiàn)異常酸化現(xiàn)象，表現(xiàn)為pH值降低。因此，我們?cè)O(shè)想，可以利用成骨部位pH值比正常組織低的特性，制備一種在生理范圍內(nèi)穩(wěn)定而在pH偏低的環(huán)境中不穩(wěn)定的pH敏感型載體材料，以減少不良反應(yīng)。PE為一種天然存在的不飽和磷脂，能夠形成雙層相和六角相，且兩相之間轉(zhuǎn)變時(shí)焓變極小。以PE為主要磷脂材料制備的脂質(zhì)體能夠在兩相轉(zhuǎn)變時(shí)產(chǎn)生pH敏感性，但是由于其pH敏感性較弱一直未被深入研究。因此，我們擬將具有pH敏感性的小分子物質(zhì)油酸、膽固醇和PE混合制備成pH敏感脂質(zhì)體，提高其pH敏感性?；旌喜牧暇鶠樘烊淮嬖诋a(chǎn)物，在人體內(nèi)可自行進(jìn)行生物降解，具有較好的生物相容性和安全性，相對(duì)合成材料價(jià)格較低，開發(fā)這一制劑具有極好的前景。

然而脂質(zhì)體作為自組裝微粒分散制劑，存在易絮凝、藥物易泄露等方面的問(wèn)題，即脂質(zhì)體的儲(chǔ)存及體內(nèi)穩(wěn)定性欠佳。高分子聚合物藥物載體具有良好的穩(wěn)定性，將高分子聚合物的藥物載體和基于脂質(zhì)的藥物載體適當(dāng)結(jié)合，可制備得到包覆脂質(zhì)體。包覆材料的結(jié)合能夠增加脂質(zhì)體雙層膜的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)脂質(zhì)體在體內(nèi)的存留時(shí)間和脂質(zhì)體中藥物的釋放速度[9]。因此，我們?cè)O(shè)想將GH脂質(zhì)體負(fù)載在凝膠中，對(duì)其進(jìn)行二次包封，以期達(dá)到理想的緩釋效果。

簽于目前大部分緩釋載體系統(tǒng)需要手術(shù)才能植入目標(biāo)處，因而我們?cè)O(shè)想使用一種可注射型緩釋載體系統(tǒng)以方便臨床應(yīng)用。殼聚糖基可注射型溫度敏感性水凝膠，在常溫下為液體狀態(tài)，注射入機(jī)體后隨體溫的升高，凝膠由液態(tài)變?yōu)楣虘B(tài)。此種材料是一種pH值中性的物理水凝膠，與人體內(nèi)環(huán)境的酸堿度接近，并避免有機(jī)化學(xué)試劑及其他有害的物質(zhì)，適合于敏感大分子如蛋白質(zhì)及肽類藥物的運(yùn)載。能用于藥物緩釋載體的可注射材料中，殼聚糖與甘油磷酸鈉體系(CS/GPS)是研究最多的，它可用于軟組織工程[10,11]。該體系中的甘油磷酸鹽也是公認(rèn)的無(wú)毒生物相容性物質(zhì)，因此CS/GPS體系具有良好的研究和應(yīng)用前景。

pH敏感性脂質(zhì)體作為一種新型的納米靶向載體，由一種或多種對(duì)外部pH變化敏感的脂質(zhì)和兼性穩(wěn)定劑組成，在酸性環(huán)境中不穩(wěn)定。當(dāng)外部環(huán)境pH變化時(shí)(即從中性向酸性pH變化時(shí))，pH敏感脂質(zhì)體即與內(nèi)吞膜融合，將內(nèi)容物釋放至胞質(zhì)[12]。羧甲基殼聚糖(CMCT)既含有陽(yáng)離子(-NH})基團(tuán)，又含有陰離子(-COO-)基團(tuán)，是一種兩性聚電解質(zhì)，具有特殊的pH敏感性。鏈上富含的極性基團(tuán)能在脂質(zhì)體表面形成親水層,可以逃避血液中網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的捕獲。當(dāng)介質(zhì)偏酸性時(shí)，CMCT因荷電分子鏈鏈間靜電相互作用加強(qiáng)，加上鏈內(nèi)氫鍵與疏水基團(tuán)相互作用，CMCT分子鏈構(gòu)象產(chǎn)生轉(zhuǎn)變，分子鏈卷曲程度逐步增加，形成線團(tuán)。隨pH升高，CMCT分子內(nèi)羧基被中和形成羧酸根負(fù)離子，負(fù)電荷間的相互排斥使CMCT采取松散線團(tuán)構(gòu)象。若將CMCT結(jié)合于脂質(zhì)體表面，由于環(huán)境pH變化引起CMCT構(gòu)象的改變，會(huì)迫使磷脂雙分子層發(fā)生重排，破壞脂質(zhì)體膜的屏障性質(zhì)，從而使內(nèi)容物迅速釋放，便可以實(shí)現(xiàn)pH敏感控釋。

牽張成骨的本質(zhì)是骨折愈合和骨組織的再生過(guò)程，與單純骨缺損的修復(fù)相比，它的過(guò)程存在更加復(fù)雜的炎癥反應(yīng)，局部低氧嚴(yán)重，組織在局部缺血時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和間質(zhì)液出現(xiàn)異常酸化現(xiàn)象，pH值比普通的骨折創(chuàng)傷更低更持久。因此，我們?cè)O(shè)想，首先將羧甲基殼聚糖結(jié)合于脂質(zhì)體表面，構(gòu)建具有pH敏感的納米脂質(zhì)體載體，然后用這種pH敏感納米脂質(zhì)體包裹GH，制備出pH敏感鈉米脂質(zhì)體包裹的GH。利用牽張成骨區(qū)域pH低于正常組織特點(diǎn)，通過(guò)皮下注射全身應(yīng)用pH敏感鈉米脂質(zhì)體包裹的GH，進(jìn)入血液循環(huán)后在低pH值的牽張成骨區(qū)域釋放出GH并發(fā)揮作用，而在身體其他部位保持穩(wěn)定，實(shí)現(xiàn)GH靶向歸巢于牽張成骨區(qū)域，促進(jìn)牽張成骨新骨形成和礦化。這樣不但可以使得健康組織免受藥物潛在不良作用的威脅，而且可以進(jìn)一步提高靶向性，實(shí)現(xiàn)藥物的智能控制釋放。

本研究結(jié)果顯示，8 h之前釋放藥物主要為制備脂質(zhì)體過(guò)程中未包裹的藥物，這一現(xiàn)象和所計(jì)算所得脂質(zhì)體的包封率相吻合。主要是脂質(zhì)體對(duì)藥物有一定的保護(hù)作用，從而使延緩了藥物的釋放。由于GH穩(wěn)定性較差，在這一過(guò)程中，藥物降解速度超過(guò)藥物釋放速度，因此累積釋放率出現(xiàn)下降趨勢(shì)。脂質(zhì)體在12 h后逐漸破壞，藥物釋放加快，累積釋放度逐漸增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，凝膠和脂質(zhì)體對(duì)藥物有雙重保護(hù)作用，可以起到很好的緩釋效果。超過(guò)24 h后測(cè)量藥物的累積釋放度低于47.28%。可能原因是GH在24 h之后發(fā)生降解，導(dǎo)致測(cè)量值偏低，使累積釋放度不準(zhǔn)確，不能直觀表現(xiàn)藥物釋放的具體情況。從現(xiàn)有游離藥物從凝膠中的釋放曲線可以看出，凝膠具有控制藥物緩慢釋放的作用，從而延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間。

比較負(fù)載GH脂質(zhì)體凝膠與游離藥物凝膠的釋放度發(fā)現(xiàn)，載藥物脂質(zhì)體凝膠中的藥物釋放比游離藥物凝膠釋放緩慢?？赡艿脑蛴幸韵聨c(diǎn)：①藥物包裹成脂質(zhì)體之后粒徑增大，比游離藥物分子大，不能自由地透過(guò)凝膠，有效地延緩了藥物的釋放；②PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物不同分散區(qū)域分散不同溶解度的藥物，對(duì)于水溶性高的藥物主要分散在聚合物的親水端(PEG端)，藥物的釋放以擴(kuò)散為主；而脂溶性藥物則在聚合物的疏水端(PLGA端)，需經(jīng)過(guò)與PLGA端的解離擴(kuò)散或者溶蝕才能得到釋放。包裹藥物成為脂質(zhì)體之后，藥物的脂溶性增加，在凝膠中趨向于PLGA端，延緩了藥物的釋放；③GH作為一類水溶性蛋白質(zhì)，通常存在于脂質(zhì)雙分子層的內(nèi)部水相中，能夠很好地得到保護(hù)，也在一定程度上延緩了其的釋放。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證明負(fù)載GH的脂質(zhì)體凝膠比游離GH凝膠更具有緩釋作用，為后續(xù)這一制劑的研究提供了前期的理論基礎(chǔ)，也為研究和開發(fā)高效低毒的蛋白藥物新劑型提供重要的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。