宋衛(wèi)敏,劉新磊,董玉娟,任傳濤

(1濰坊醫(yī)學(xué)院附屬益都中心醫(yī)院，山東青州262500；2德州市人民醫(yī)院)

食管癌是最常見的高度惡性腫瘤，西方歐美國家以食管腺癌為主，而在中國等亞洲國家以食管鱗癌為主[1]。食管癌往往發(fā)現(xiàn)較晚，雖然目前手術(shù)及放化療等治療手段不斷改進，但由于延誤診斷和高復(fù)發(fā)率，食管癌患者的5年生存率仍然較低[2，3]。至今，食管癌的病因及發(fā)展機制尚不明確，仍缺少有效的分子標(biāo)志物和靶向治療靶點，因此從分子水平闡明食管癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移的分子機制，尋找特定有效的分子靶向治療靶點，建立有效的早期診斷、精確評估、判斷預(yù)后的新方法具有重大意義。微小核糖核酸(miRNA)是一類長度在19～22個核苷酸的內(nèi)源性、高度保守的單鏈非編碼小RNA，可以通過靶向結(jié)合目標(biāo)mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能[4，5]。近年研究證實，miRNA在細胞增殖、凋亡、發(fā)展和分化中起著重要調(diào)控作用，并與腫瘤的發(fā)病、進展及預(yù)后關(guān)系密切[6，7]。miR-93是近期發(fā)現(xiàn)的miRNA家族重要成員之一，屬于miR-106b-25 miRNA簇成員。目前研究發(fā)現(xiàn)，miR-93在許多惡性腫瘤組織中表達異常，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[8]。但目前有關(guān)miR-93在食管鱗癌中表達情況的研究甚少。2017年11月～2018年4月，本研究通過qRT-PCR法檢測食管鱗癌細胞系和正常食管細胞系、食管鱗癌組織和癌旁組織中miR-93的表達情況，并進一步分析其與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞及組織：人食管鱗癌細胞系KYSE410、ECA-109、KYSE-510和人食管正常細胞系Het-1A均購自中國科學(xué)院上海細胞研究所。細胞均置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。濰坊醫(yī)學(xué)院附屬益都中心醫(yī)院和德州市人民醫(yī)院手術(shù)切除的食管鱗癌組織和對應(yīng)的癌旁組織(距離腫瘤邊緣至少5 cm)新鮮標(biāo)本110例份，組織標(biāo)本在離體30 min內(nèi)生理鹽水清洗后置入液氮中，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。患者術(shù)前均未進行放、化療及生物免疫治療等任何抗腫瘤治療，并且未合并其他器官的惡性腫瘤。手術(shù)后標(biāo)本均經(jīng)病理檢查證實為鱗狀細胞癌。110例份組織中，患者男78例，女32例；年齡>60歲84例，≤60歲26例；腫瘤直徑>5 cm 65例，腫瘤直徑≤5 cm 45例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期60例，Ⅲ期50例；腫瘤位置：上段13例，中下段97例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移71例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例。患者均簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。試劑及儀器：TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及qRT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；miR-93及內(nèi)參U6引物購自廣州銳博生物技術(shù)公司；LightCycle 96熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司。

1.2 組織或細胞miR-93表達的檢測 采用qRT-PCR法。嚴(yán)格按照TRIzol試劑盒說明書操作提取組織或細胞總RNA，分光光度計檢測提取的RNA純度和濃度，以吸光度(A)值A(chǔ)260nm/A280nm在1.9～2.0范圍內(nèi)的RNA作為合格標(biāo)準(zhǔn)用于后續(xù)實驗。取總RNA,參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作逆轉(zhuǎn)錄cDNA。以cDNA為模板，利用qRT-PCR試劑盒及特異性引物進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。miR-93引物序列：上游引物：5′-AGTCTCTGGGCTGACTACATCACAG-3′，下游引物：5′-CTACTCACAAAACAGGAGTGGAATC-3′；U6引物序列：上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，共40個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參照計算miR-93的相對表達量，相對表達量數(shù)值采用2-ΔΔCt法計算。

2 結(jié)果

2.1 miR-93在食管鱗癌細胞系和食管正常細胞系中的表達 KYSE410、ECA-109、KYSE-510、Het-1A中miR-93的相對表達水平分別為1.01±0.05、5.18±0.23、4.39±0.21、3.36±0.28。與人食管正常細胞系Het-1A相比，人食管鱗癌細胞系KYSE410、ECA-109、KYSE-510中miR-93的表達水平升高(P均<0.01)。見圖1。

2.2 miR-93在食管鱗癌組織和癌旁組織中的表達 miR-93在食管鱗癌組織和相對應(yīng)的癌旁組織中相對表達水平分別為1.03±0.07、7.45±0.45。與癌旁組織相比，食管鱗癌組織中miR-93的表達水平升高(P均<0.01)。見圖2。

2.3 miR-93表達與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 以miR-93的均值水平為界值，將患者分為miR-93高表達(≥7.45)組58例和miR-93低表達(<7.45)組52例。miR-93的表達與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)(P均<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑及腫瘤位置無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

圖1 miR-93在食管鱗癌細胞系和食管正常細胞系中的表達

注：與Het-1A相比，*P<0.01。

圖2 miR-93在食管鱗癌組織和癌旁組織中的表達

表1 miR-93表達與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

2.4 miR-93表達與食管鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，miR-93高表達患者預(yù)后較差(P<0.01)，見圖3。Cox多因素回歸分析結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、miR-93表達是影響患者預(yù)后的獨立危險因素(P均<0.05)。見表2。

圖3 食管鱗癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

表2 食管鱗癌患者預(yù)后的Cox回歸分析

3 討論

近年，雖然食管癌的手術(shù)及藥物治療取得了一定發(fā)展，但食管癌預(yù)后仍然較差，食管癌的局部復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是目前制約患者治療效果，影響其生存期進一步提高的主要瓶頸之一。目前食管癌的發(fā)生發(fā)展機制尚不完全明確，尚無有效的靶向治療藥物。

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在多種癌癥中表達異常，在腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲及遷移方面起著重要作用，已成為目前腫瘤研究及基因治療的熱點問題[9]。在食管癌方面，已經(jīng)證實有許多miRNA參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移等[10,11]。miR-93屬于miR-106b-25 miRNA簇(miR-106b、miR-93、miR-25)成員之一。既往研究表明，miR-93在眾多不同的惡性腫瘤組織中均出現(xiàn)表達水平異常，如在胃癌[12]、肝細胞癌[13]、子宮內(nèi)膜癌[14]、骨肉瘤[15]中表達增強，而在結(jié)腸癌[16]、乳腺癌[17]等中表達受到抑制，但其具體功能尚不清楚。miR-93在不同腫瘤中可能作用于不同的靶基因，從而起著不同的作用。目前，有關(guān)miR-93在食管鱗癌中表達情況的研究甚少。本研究通過qRT-PCR檢測了110例份食管鱗癌組織和相對應(yīng)的癌旁組織，人食管鱗癌細胞系KYSE410、ECA-109、KYSE-510和人食管正常細胞系Het-1A中miR-93的表達水平后發(fā)現(xiàn)，miR-93在食管鱗狀組織和細胞中表達異常增高；并且進一步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，miR-93的表達與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)，提示miR-93的表達水平異常與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

目前，有關(guān)miR-93與惡性腫瘤患者預(yù)后關(guān)系的研究較少。已有研究報道，在頭頸部鱗癌[18]、胃癌[19]中miR-93的高表達與患者的不良預(yù)后相關(guān)。本研究中我們通過對食管鱗癌患者進行了術(shù)后隨訪，也發(fā)現(xiàn)miR-93高表達組患者預(yù)后較差。同時我們進一步通過多變量Cox回歸模型分析顯示，miR-93高表達是影響患者預(yù)后的獨立危險因素，提示miR-93可以作為判斷食管鱗癌預(yù)后的分子生物學(xué)標(biāo)志物。

綜上所述，食管鱗癌中miR-93表達異常增高，其異常高表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，并且是影響患者預(yù)后的獨立危險因素，本研究為食管鱗癌的靶向治療以及預(yù)后預(yù)測提供了新的方向。