應(yīng) 穎，陳 勇，張 順，黃海燕，李曉可，鄒榮鑫，褚贊波，黃嫻倩，彭 勇，干敏芝，耿保慶，朱夢雅，王筱萍

作者單位：315010浙江寧波，寧波市第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科(應(yīng)穎、陳勇、黃嫻倩、彭勇、干敏芝、耿保慶、朱夢雅、王筱萍)、肝細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)實驗室(張順)；310000，寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院(黃海燕、李曉可、鄒榮鑫、褚贊波)

原發(fā)性痛風(fēng)是指尿酸鹽結(jié)晶在關(guān)節(jié)沉積而引起的關(guān)節(jié)疾病，由于其發(fā)病與嘌呤代謝紊亂和/或尿酸排泄障礙所導(dǎo)致的高尿酸血癥有關(guān)，因此屬于代謝性風(fēng)濕性疾病[1-2]。在全球范圍內(nèi)，原發(fā)性痛風(fēng)和高尿酸血癥的患病率呈逐年增長趨勢。2012年美國原發(fā)性痛風(fēng)的患病率為2.49%[3];中國2000年至2014年期間高尿酸血癥的患病率約為13.3%，原發(fā)性痛風(fēng)的患病率是1.1%[4]。

在過去的10年中，大量的文獻(xiàn)包括全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association studies，GWAS)和薈萃分析均將原發(fā)性痛風(fēng)發(fā)病機(jī)制研究聚焦在基因方面，許多與尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的基因能夠通過影響腎小管對尿酸的重吸收及分泌從而影響尿酸的水平，如SLC2A9、SLC22A12、ABCG2 和SLC17A3基因[5]。也有一些與固有免疫相關(guān)的基因參與一些炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，從而導(dǎo)致原發(fā)性痛風(fēng)的急性發(fā)作，如P2RX7基因[6-7]。

有文獻(xiàn)指出，表觀遺傳學(xué)在腫瘤、糖尿病和高血壓的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[8-9]，基因甲基化是表觀遺傳學(xué)中最為常見的一種?；蚣谆侵冈诨蛐蛄胁话l(fā)生改變的情況下，基因的表達(dá)和功能發(fā)生改變，從而產(chǎn)生可遺傳的表型?；蚣谆饕l(fā)生在CpG島的CG二核苷酸上，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化下，胞嘧啶(C)被轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶 (5mC)。一般情況下基因甲基化會抑制基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致蛋白水平下降[10]。本研究的目的是探討尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因(SLC2A9、SLC22A12 和ABCG2)和固有免疫反應(yīng)相關(guān)基因(P2RX7)甲基化在原發(fā)性痛風(fēng)發(fā)病中的作用，為原發(fā)性痛風(fēng)的早期診斷提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2016年1月至2017年1月在寧波市第二醫(yī)院就診的50例原發(fā)性痛風(fēng)患者和50例健康體檢對照者，均為漢族男性。原發(fā)性痛風(fēng)的診斷符合2015 ACR/EULAR 痛風(fēng)分類標(biāo)準(zhǔn)[11]。健康對照組排除原發(fā)性痛風(fēng)等自身免疫性疾病、糖尿病等代謝性疾病及腫瘤等。受檢者之間無血緣關(guān)系，研究過程遵守赫爾辛基宣言的倫理準(zhǔn)則，并經(jīng)寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院寧波市第二醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均自愿簽署知情同意書。

由兩名檢查人員核對并記錄受檢者年齡、性別、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、肌酐(creatinine，CREA)、尿酸(uric acid，UA)、血糖(glucose，GLU)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、三酰甘油(triglyceride，TG)和白細(xì)胞計數(shù)(white blood cell count，WBC)。

1.2 基因甲基化水平檢測方法

收集受檢者外周血1 ml至質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% EDTA管中。用QIAamp DNA試劑盒(Qiagen公司，德國希爾登)提取全基因組DNA，并置于 -80 ℃冰箱保存。用DNA甲基化修飾試劑盒(美國Zymo公司)對DNA進(jìn)行亞硫酸鹽修飾。PCR引物合成由PyroMark Assay Design 2.0設(shè)計，由華大基因合成(引物序列詳見表1)。PCR反應(yīng)體系20 μl，包括H2O 6.8 μl，上游引物(up 50 pmol/μl)0.6 μl，下游引物 (down 50 pmol/μl)0.6 μl，DNA 聚合酶10 μl，DNA 2 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 變性30 s，X ℃ 退火40 s(SLC2A9 50 ℃，SLC22A12 52 ℃，ABCG2 48 ℃，P2RX7 56 ℃)，72 ℃ 延伸50 s，共 45個循環(huán)；72 ℃再延伸7 min。用焦磷酸檢測儀(PyroMark Q96 ID，QIAGEN)進(jìn)行甲基化水平檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

痛風(fēng)組患者CREA、UA、GLU、TG和WBC測定值均明顯高于對照組，LDL-C測定值明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.029、<0.001、<0.001、<0.001、<0.001、0.012)，兩組受檢者年齡、ALT、AST、TC和HDL-C測定值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)(表2)。

表1 各基因引物序列Table 1 Primer sequence of various genes

表2 痛風(fēng)組與對照組臨床資料和實驗室測定指標(biāo)Table 21 Clinical findings and laboratory results between gout group and control group

2.2 各組受檢者基因啟動子區(qū)甲基化水平比較

兩組受檢者SLC2A9 pos 1-7、SLC22A12 pos 1-2、ABCG2 pos 1-6及P2RX7 pos 1-2位點的甲基化水平進(jìn)行比較，痛風(fēng)組受檢者SLC2A9(pos1、3、4、5、7)、SLC22A12 pos 2和ABCG2(pos1、2、4、5、6)甲基化率均明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩組間其他基因位點甲基化率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

3 討論

基因表觀遺傳的調(diào)控主要有以下幾種：(1)基因轉(zhuǎn)錄過程調(diào)控；(2)基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控；(3)蛋白質(zhì)翻譯后調(diào)控。近年來基因表觀遺傳的主要研究都集中在對基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控環(huán)節(jié)，這部分調(diào)控又包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和非編碼RNA調(diào)控等[12]。保持人體DNA的甲基化穩(wěn)定狀態(tài)十分重要，主要體現(xiàn)于正常細(xì)胞功能的維持、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)維持、基因印記、X染色體失活、以及胚胎發(fā)育等[13-14]。DNA去甲基化是指5-甲基胞嘧啶(5mC)轉(zhuǎn)變成胞嘧啶(C)。在體內(nèi)，DNA去甲基化與DNA甲基化狀態(tài)相互平衡，以維持人體DNA甲基化譜的穩(wěn)定，該狀態(tài)的失衡會導(dǎo)致DNA甲基化譜紊亂，引起免疫系統(tǒng)紊亂及腫瘤等相關(guān)疾病[15]。

果糖轉(zhuǎn)運(yùn)子9(glucose transporter family member 9,GLUT9)亦稱為電勢驅(qū)動尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(voltage-driven urate transporter 1，URATv1)，由基因SLC2A9編碼，根據(jù)氨基末端不同分為GLUT9a及GLUT9b兩種亞型。GLUT9最初作為葡萄糖和果糖的轉(zhuǎn)運(yùn)體而被發(fā)現(xiàn)[16]，當(dāng)細(xì)胞外K+濃度升高時，該蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)功能增強(qiáng)[17-18]。2008年，Vitart等[19]通過爪蟾卵模型實驗在克羅地亞人群中證實尿酸質(zhì)量濃度變化達(dá)1.7%～5.3%時與SLC2A9基因序列變異有關(guān)。之后的進(jìn)一步研究證實GLUT9a分布于基底外側(cè)膜，可能與尿酸鹽從近端小管中排出有關(guān)，而GLUT9b則分布于頂端膜，其作用可能為協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)尿酸鹽通過頂端膜進(jìn)入近端小管上皮細(xì)胞，主要介導(dǎo)尿酸的重吸收[20]。隨后許多研究進(jìn)一步證實SLC2A9基因多態(tài)性與血清尿酸水平有著密切的聯(lián)系[21]。

人類尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)子1(human urinary transporter 1，hURAT1)有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)(organic anion transporter，OAT)家族中新的一員， 由555 氨基酸及12個跨膜區(qū)域組成[22-23]。hURAT1由SLC22A12基因編碼，主要表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞的刷狀緣的邊緣，介導(dǎo)細(xì)胞外的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)[24-25]。 Hosoyamada等[26]在SLC22A12基因敲除小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)，尿酸及肌酐水平與hURAT1 蛋白有關(guān)，Guan等[27]在124例原發(fā)性痛風(fēng)及168例健康對照者的樣本試驗中亦證實SLC22A12 rs893006 多態(tài)性可能與原發(fā)性痛風(fēng)的發(fā)病有關(guān)。

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G2(ATP-binding cassette superfamaily G member 2，ABCG2)是一種ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由6個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域及1個單獨的ATP結(jié)合域組成，廣泛存在于正常組織中，發(fā)揮維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、減輕細(xì)胞在低氧環(huán)境下?lián)p傷的作用，屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體家族。ABCG2基因在腎臟、膽囊、腸道上皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)[28-29]。Hosomi等[30]對亞洲的高尿酸血癥患者與健康對照者進(jìn)行研究，將ABCG2基因的功能分成4個等級，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，高尿酸血癥患者的ABCG2基因功能明顯缺陷，從而證實ABCG2基因功能與尿酸排泄有著聯(lián)系。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，腎臟中ABCG2基因表達(dá)在近端小管上皮細(xì)胞頂膜，參與尿酸的分泌作用[31]。

表3 痛風(fēng)組與對照組SLC2A9、SLC22A12、ABCG2和P2RX7基因甲基化率比較Table 3 Comparison of DNA methylation rate of SLC2A9,SLC22A12,ABCG2 and P2RX7 between gout group

P2X7受體屬于嘌呤受體P2X家族，由595個氨基酸組成，具有陽離子(Na+、K+和Ca2+)選擇性[32-33]。已有研究發(fā)現(xiàn)，P2RX7基因與系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫性疾病相關(guān)[34-35]。在原發(fā)性痛風(fēng)的發(fā)病中，P2X7受體主要在NF-κB途徑和NALP3炎性途徑中發(fā)揮重要作用[36-37]。ATP是其唯一的天然激動劑，當(dāng)劇烈運(yùn)動、寒冷刺激、酗酒及暴飲暴食等導(dǎo)致細(xì)胞外的ATP濃度發(fā)生急劇的變化時，P2X7受體被激活并開放，導(dǎo)致K+外流及Na+和Ca2+內(nèi)流，胞內(nèi)的低鉀狀態(tài)進(jìn)一步激活NALP3炎性體，活化的caspase-1將IL-1催化為成熟的IL-1β，從而導(dǎo)致大量的IL-1β釋放出胞外[38-42]。

在本研究中，SLC22A12基因和P2RX7基因沒有CpG島，因此選取其啟動子區(qū)的位點進(jìn)行甲基化率檢測。在原發(fā)性痛風(fēng)組中，SLC2A9(pos 1、3、4、5、7)處于低甲基化水平，可能會引起GLUT9蛋白的高表達(dá)，尿酸重吸收增加，導(dǎo)致血清尿酸的增加，最終可能影響痛風(fēng)的發(fā)作。本實驗結(jié)果可以解釋痛風(fēng)的發(fā)病機(jī)制，但是本研究只研究了甲基化水平與原發(fā)性痛風(fēng)的關(guān)系，并沒有進(jìn)一步探討SLC2A9基因表達(dá)是否與本實驗的甲基化結(jié)果相符，可在今后的實驗中進(jìn)一步研究。SLC22A12 pos 2處于高甲基狀態(tài)，可以推測hURAT蛋白的表達(dá)將會減少，尿酸的重吸收將會減少，尿酸水平降低。同樣ABCG2(pos 1、2、4、5、6)處于低甲基化狀態(tài)，ABCG2蛋白表達(dá)將會增加，尿酸分泌增加，尿酸水平降低。但是從SLC22A12基因和ABCG2基因的甲基化表達(dá)功能分析無法解釋痛風(fēng)的發(fā)病機(jī)制。痛風(fēng)組與對照組P2RX7基因位點甲基化水平無明顯差異，因此P2X7受體蛋白過度表達(dá)不由P2RX7基因的甲基化調(diào)控。今后研究可繼續(xù)在高尿酸血癥患者中進(jìn)一步探討上述基因的甲基化情況。

本研究仍有一些不足，首先，我們只研究了甲基化水平與原發(fā)性痛風(fēng)的關(guān)系，并沒有從機(jī)制上進(jìn)一步探討，今后可進(jìn)一步探討SLC2A9基因的表達(dá)情況是否與本實驗甲基化結(jié)果相符，從而明確SLC2A9基因低甲基化是痛風(fēng)的發(fā)病風(fēng)險，并探討該基因甲基化對痛風(fēng)疾病的診斷價值，以做到痛風(fēng)的早期診斷。其次，在本研究中，SLC22A12、ABCG2及P2RX7基因的甲基化結(jié)果不能解釋痛風(fēng)的發(fā)病機(jī)制，仍需要更大樣本的研究去進(jìn)一步驗證實驗結(jié)果。第三，本研究只對外周血細(xì)胞基因甲基化進(jìn)行研究，對于腎臟組織以及滑膜組織的甲基化水平情況并未涉及，因此無法將不同組織細(xì)胞的基因甲基化水平進(jìn)行比較。第四，本研究樣本數(shù)量較少，且均來自同一個研究中心。第五，本研究沒有涉及女性。第六，只對已報道的基因做了檢測，可能存在其他未報道且與原發(fā)性痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)的基因。在今后的研究中，仍可通過甲基化基因芯片去篩選更多有意義的基因。第七，由于缺乏其他地區(qū)及種族上述基因的文獻(xiàn)報道，因此無法將寧波漢族人群與其他地區(qū)進(jìn)行比較。

總之，SLC2A9(pos 1、3、4、5、7)低甲基化水平可能增加原發(fā)性痛風(fēng)的風(fēng)險。