喬 玲, 于 杰, 李 迎, 甄 毓? ?, 米鐵柱, 張玲玲, 5, 包振民, 5

(1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100；2.中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100； 3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071； 4. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003； 5. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071)

基于高通量測(cè)序分析的榮成扇貝養(yǎng)殖區(qū)微型 浮游生物群落結(jié)構(gòu)研究?

喬 玲1, 2, 3, 于 杰4, 李 迎1, 2, 3, 甄 毓1, 2, 3? ?, 米鐵柱1, 2, 3, 張玲玲4, 5, 包振民4, 5

(1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100；2.中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100； 3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071； 4. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003； 5. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071)

運(yùn)用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)2011年7月榮成八河扇貝養(yǎng)殖區(qū)和楮島扇貝養(yǎng)殖區(qū)中微型浮游生物群落組成特征進(jìn)行研究，結(jié)果表明，在浮游植物種類組成上，2個(gè)樣品中共檢測(cè)到22個(gè)綱，其中海金藻、硅藻、綠藻、甲藻和隱藻是主要類群，多形微眼藻和抑食金球藻的18S rDNA相對(duì)豐度較高；在浮游動(dòng)物種類組成上，2個(gè)樣品中共檢測(cè)到16個(gè)門，在八河扇貝養(yǎng)殖區(qū)18S rDNA相對(duì)豐度較高的浮游動(dòng)物是軟體動(dòng)物、有孔蟲和纖毛蟲，而在楮島扇貝養(yǎng)殖區(qū)則是環(huán)節(jié)動(dòng)物的18S rDNA相對(duì)豐度較高。結(jié)果表明，榮成扇貝養(yǎng)殖區(qū)有暴發(fā)褐潮的可能，需采取有效措施進(jìn)行應(yīng)對(duì)。

抑食金球藻；多形微眼藻；18S rDNA基因；高通量測(cè)序

2009年6月，河北秦皇島沿岸海域暴發(fā)了抑食金球藻(Aureococcusanophagefferens)褐潮，褐潮區(qū)從山海關(guān)延伸至撫寧，寬度約15 km，養(yǎng)殖的扇貝等出現(xiàn)滯長(zhǎng)現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致貝類死亡。2010年，褐潮影響面積擴(kuò)大到3 350 km2，造成直接經(jīng)濟(jì)損失約2億元[1]。2011年夏季，威海的桑溝灣和煙臺(tái)的四十里灣也出現(xiàn)該種褐潮[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，抑食金球藻褐潮的暴發(fā)可能與海水養(yǎng)殖有關(guān)[4-5]。榮成市三面臨海，水產(chǎn)資源十分豐富，是中國(guó)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖基地之一，主要養(yǎng)殖種類包括藻類、貝類、魚類、海參等。2011年榮成市海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量為61.9萬(wàn)t，比2010年增加了約1.2萬(wàn)t，養(yǎng)殖總面積約310 km2，總產(chǎn)值約90.6億元[6]。隨著海水養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖面積和產(chǎn)量也大幅度提高，高密度的養(yǎng)殖使大量的有機(jī)物、營(yíng)養(yǎng)鹽類、抗生素、生長(zhǎng)激素以及養(yǎng)殖生物的排泄物和代謝產(chǎn)物進(jìn)入養(yǎng)殖水域，不可避免地對(duì)海洋環(huán)境造成污染和破壞[7-9]。對(duì)浮游生物而言，生境的改變可能會(huì)造成群落組成和結(jié)構(gòu)的改變。

對(duì)浮游生物群落組成及多樣性的檢測(cè)方法有很多，包括顯微鏡計(jì)數(shù)、克隆文庫(kù)技術(shù)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性、變性梯度凝膠電泳、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、高通量測(cè)序技術(shù)等[5, 10-18]。其中，高通量測(cè)序技術(shù)因具有簡(jiǎn)單快速、成本低和測(cè)序通量高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于宏基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因組學(xué)等領(lǐng)域中[16, 19-21]，為浮游生物群落組成及多樣性研究提供了新的方法。真核生物核糖體的18S rDNA基因序列上交替排列著保守區(qū)和可變區(qū)(V1～V9，沒(méi)有V6區(qū))[22]，保守區(qū)能體現(xiàn)生物物種間的親緣關(guān)系[23]，而可變序列區(qū)則反映了物種間的差異，可用于鑒定不同物種。真核生物的8個(gè)可變區(qū)中，V9區(qū)變異性較高、長(zhǎng)度較短且易于擴(kuò)增和測(cè)序，可作為標(biāo)記基因應(yīng)用于浮游生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性研究中[24-25]。Amaral-Zettler等設(shè)計(jì)了18S rDNA V9區(qū)的通用引物，利用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)分析了海洋真核生物的群落結(jié)構(gòu)及多樣性，從而為研究海洋真核生物多樣性開(kāi)辟了新路[24]。

本研究選取真核生物18S rDNA可變區(qū)V9區(qū)作為標(biāo)記基因，結(jié)合Illumina高通量測(cè)序與實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)，對(duì)榮成八河扇貝養(yǎng)殖區(qū)和楮島扇貝養(yǎng)殖區(qū)微型浮游生物的群落組成、多樣性和豐度進(jìn)行了調(diào)查和分析，以探討扇貝養(yǎng)殖對(duì)微型浮游生物群落結(jié)構(gòu)的影響，為發(fā)展扇貝的健康養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品于2011年7月14日采自榮成八河扇貝養(yǎng)殖區(qū)和楮島扇貝養(yǎng)殖區(qū)，調(diào)查海區(qū)及站位如圖1所示。取500 mL表層海水，經(jīng)20 μm微孔濾膜過(guò)濾，去除懸浮顆粒物及較大的浮游生物，再用2 μm微孔濾膜過(guò)濾，收集海水中的微型浮游生物，將濾膜放入液氮保存，用于分析采樣點(diǎn)微型浮游生物的群落組成及多樣性。

圖1 采樣站位分布圖Fig.1 Locations of the sampling stations

1.2 高通量測(cè)序

利用溴化十六烷基三甲胺(Cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB)法提取基因組DNA[26]，用通用引物V9F(5′-CCCTGCCHTTTGTACACAC)和V9R(5′-CCTTCYGCAGGTTCACCTAC)擴(kuò)增18S rDNA可變區(qū)V9區(qū)[24]，PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序詳見(jiàn)文獻(xiàn)[27-28]。反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(QIAGEN，德國(guó))純化上述所得的PCR產(chǎn)物，用超微量分光光度計(jì)(GE Healthcare，美國(guó))測(cè)定純化后產(chǎn)物濃度，進(jìn)行3’末端加A，反應(yīng)體系詳見(jiàn)文獻(xiàn)[28]。72 ℃反應(yīng)20 min后，利用MinElute PCR產(chǎn)物純化試劑盒(QIAGEN，德國(guó))純化，產(chǎn)物溶于13 μL洗脫緩沖液(10 mmol/L Tris-Cl，pH=8.5)進(jìn)行接頭連接。反應(yīng)體系及反應(yīng)程序詳見(jiàn)文獻(xiàn)[28]。然后向PCR片段引入barcode序列，反應(yīng)體系及PCR反應(yīng)程序詳見(jiàn)文獻(xiàn)[28]。所得產(chǎn)物用1.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳條件為100 V、35 min。對(duì)目的片段用MinElute瓊脂糖凝膠回收試劑盒(QIAGEN，德國(guó))做膠回收純化，純化后的產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，并用超微量分光光度計(jì)(GE Healthcare，美國(guó))測(cè)定產(chǎn)物濃度。采用Illumina HiSeq 2000平臺(tái)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行PE100測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 數(shù)據(jù)拼接和質(zhì)量控制 使用PANDAseq(http://github.com/neufeld/pandaseq/wiki/PANDAseq-Assembler)軟件對(duì)測(cè)得的原始序列進(jìn)行拼接，去掉引物序列，并對(duì)各序列進(jìn)行質(zhì)量篩選，去掉堿基質(zhì)量值較低的序列，最終得到高質(zhì)量序列。

1.3.2 OTU劃分及代表序列的注釋 使用Uparse(http://www.drive5.com/uparse)對(duì)獲得的高質(zhì)量序列在相似性為95%的水平上進(jìn)行操作分類單元(OTU)的劃分，把得到的OTUs代表序列與SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.arb-silva.de/, Version 108)進(jìn)行比對(duì)，得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息，對(duì)代表序列的注釋信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析該扇貝養(yǎng)殖區(qū)微型浮游生物的組成結(jié)構(gòu)。

1.3.3 浮游生物群落分析 為比較樣品間浮游生物多樣性的差異，按照樣品中序列數(shù)的最小值，對(duì)樣品序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣，從而將不同樣品的測(cè)序深度平等化[29]。

利用Qiime(http://qiime.org)軟件計(jì)算樣品的Alpha多樣性指數(shù)，包括Chao I指數(shù)、shannon指數(shù)、Good’s覆蓋率。Chao I指數(shù)用于表征群落的物種豐富度，Shannon指數(shù)用于衡量群落多樣性，Good’s覆蓋率用于評(píng)估測(cè)序深度。

1.4 環(huán)境樣品中18S rDNA基因拷貝數(shù)的定量分析

以環(huán)境樣品的基因組DNA為模板，用真核生物可變區(qū)V9區(qū)通用引物V9F(5′-CCCTGCCHTTTGTACACAC)和V9R(5′-CCTTCYGCAGGTTCACCTAC)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[28]。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，對(duì)目的片段用DNA膠回收試劑盒(Takara，大連)純化，然后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)。選取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，用超微量紫外分光光度計(jì)(Picodrop，英國(guó))測(cè)定質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，計(jì)算得到質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品中18S rDNA的拷貝濃度為4.67×1010copies/μL，對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品做10倍梯度稀釋，用于質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

以梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，用FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)試劑盒進(jìn)行qPCR。反應(yīng)程序如下：50℃ 2 min、95℃ 10 min、95℃ 15 s、55℃ 40 s、72℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)。以質(zhì)粒拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，平均Ct值為縱坐標(biāo)，繪制質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以2011年7月八河扇貝養(yǎng)殖區(qū)和楮島扇貝養(yǎng)殖區(qū)的環(huán)境樣品總DNA為模板，用上述反應(yīng)程序，通過(guò)qPCR獲得各樣品中18S rDNA基因的Ct值，并通過(guò)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品中浮游生物18S rDNA基因總拷貝數(shù)。各物種的18S rDNA基因拷貝數(shù)則通過(guò)計(jì)算各物種的18S rDNA相對(duì)豐度與18S rDNA基因總拷貝數(shù)的乘積得到，物種的18S rDNA相對(duì)豐度則是測(cè)序得到的該物種的序列數(shù)占總序列數(shù)的比例。

1.5 高通量測(cè)序序列登錄號(hào)

將本研究測(cè)序得到的真核生物18S rDNA V9區(qū)基因核酸序列上傳至NCBI高通量測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)Sequence Read Archive(SRA)，登錄號(hào)為SRP093585。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)預(yù)處理

對(duì)八河和楮島兩個(gè)樣品中微型浮游生物18S rDNA基因進(jìn)行Illumina高通量測(cè)序，分別獲得301 465和361 963條原始序列，通過(guò)質(zhì)量過(guò)濾，分別得到262 219和313 131條高質(zhì)量序列。經(jīng)過(guò)隨機(jī)取樣將測(cè)序深度均一化之后，每個(gè)樣品保留262 219條序列。在95%相似性水平上劃分OTUs，共得到1 396個(gè)OTUs，且八河扇貝養(yǎng)殖區(qū)的OTUs數(shù)明顯高于楮島扇貝養(yǎng)殖區(qū)的OTUs數(shù)(見(jiàn)表1)。

表1 采樣站位不同樣品的原始序列數(shù)、高質(zhì)量序列數(shù)和OTUs數(shù)Table 1 The raw reads, high quality reads and OTUs in different samples

把得到的OTUs代表序列與SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.arb-silva.de/, Version 108)進(jìn)行比對(duì)，注釋得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息。在1 396個(gè)OTU中，僅有806個(gè)OTU注釋到真核生物界，其中注釋到門、綱、屬、種4個(gè)分類單元的OTU分別為397、229、182和127個(gè)，分別占OTU總數(shù)的28.44%、16.40%、13.04%和9.10%。一些18S rDNA相對(duì)豐度較高的OTU未能注釋到綱，為全面分析浮游生物的群落組成和結(jié)構(gòu)，將未注釋到綱但18S rDNA相對(duì)豐度大于0.1%的物種的序列在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上進(jìn)行比對(duì)，手工注釋其分類信息。

2.2 浮游生物多樣性分析

通過(guò)對(duì)八河扇貝養(yǎng)殖區(qū)和楮島扇貝養(yǎng)殖區(qū)的微型浮游生物群落多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)八河扇貝養(yǎng)殖區(qū)同時(shí)具有較高的Chao I指數(shù)和Shannon指數(shù)(見(jiàn)表2)，表明八河扇貝養(yǎng)殖區(qū)的微型浮游生物多樣性高于楮島扇貝養(yǎng)殖區(qū)；2個(gè)采樣點(diǎn)的Good’s覆蓋率均高于99.9%，且隨著序列數(shù)的增加，稀釋曲線趨于平穩(wěn)(見(jiàn)圖2)，說(shuō)明現(xiàn)有的測(cè)序深度足以反映樣品中絕大多數(shù)微型浮游生物信息。

表2 采樣站位微型浮游生物群落多樣性指數(shù)Table 2 The diversity index for nanoplankton community in different samples

圖2 采樣站位各樣品的稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curve of each sample

2.3 浮游生物群落組成

八河扇貝養(yǎng)殖區(qū)和楮島扇貝養(yǎng)殖區(qū)的微型浮游生物組成情況如圖3所示，在八河扇貝養(yǎng)殖區(qū)，浮游植物、浮游動(dòng)物和真菌分別占總浮游生物的68.53%、15.38%和0.50%；在楮島扇貝養(yǎng)殖區(qū)，浮游植物、浮游動(dòng)物和真菌則分別占總浮游生物的80.01%、0.70%和0.01%，浮游植物18S rDNA相對(duì)豐度較高的是楮島扇貝養(yǎng)殖區(qū)，而浮游動(dòng)物18S rDNA相對(duì)豐度較高的則是八河扇貝養(yǎng)殖區(qū)。

圖3 采樣站位微型浮游生物18S rDNA相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of 18S rDNA from nanoplankton in different samples

微型浮游植物在綱分類水平上的群落組成情況如圖4a所示。2個(gè)樣品中共檢測(cè)到22個(gè)綱，海金藻綱(Pelagophyceae)、中型硅藻綱(Mediophyceae)、圓篩藻綱(Coscinodiscophyceae)、甲藻綱(Dinophyceae)、Mamiellophyceae、 隱藻綱(Cryptophyceae)、 共球藻綱(Trebouxiophyceae)、真眼點(diǎn)藻綱(Eustigmatophyceae)定鞭藻綱(Haptophyceae)、金藻綱(Chrysophyceae)是18S rDNA相對(duì)豐度較高的10個(gè)綱。在八河扇貝養(yǎng)殖區(qū)，硅藻是主要類群，約占總浮游生物的39.04%，其次是海金藻、綠藻、甲藻和隱藻，分別占總浮游生物的19.66%、4.05%、3.30%和1.16%；在楮島扇貝養(yǎng)殖區(qū)，海金藻是主要類群，約占總浮游生物的73.07%，其次是隱藻、綠藻和硅藻，分別占總浮游生物的1.91%、1.84%和1.49%。

微型浮游動(dòng)物在門分類水平上的群落組成情況如圖4b所示。2個(gè)樣品中共檢測(cè)到15個(gè)門，軟體動(dòng)物門(Mollusca)、有孔蟲門(Foraminifera)、纖毛蟲門(Ciliophora)、環(huán)節(jié)動(dòng)物門(Annelida)和絲足蟲門(Cercozoa)是18S rDNA相對(duì)豐度較高的5個(gè)門。在八河扇貝養(yǎng)殖區(qū)，18S rDNA相對(duì)豐度最高的浮游動(dòng)物是軟體動(dòng)物，其次是有孔蟲和纖毛蟲，分別占總浮游生物的11.25%、2.32%和1.02%；而在楮島扇貝養(yǎng)殖區(qū)，18S rDNA相對(duì)豐度最高的則是環(huán)節(jié)動(dòng)物，其次是絲足蟲和纖毛蟲，分別占總浮游生物的0.37%、0.14%和0.11%。

(A.微型浮游植物在綱分類水平上的18S rDNA相對(duì)豐度；b.微型浮游動(dòng)物在門分類水平上的18S rDNA相對(duì)豐度。a. Nanophytoplankton at class level; b.Nanozooplankton at phylum level.)

圖4 采樣站位微型浮游生物的18S rDNA相對(duì)豐度
Fig.4 Relative abundance of 18S rDNA from nanoplankton in different samples

為更直觀的體現(xiàn)不同站位群落組成的差異性和相似性，構(gòu)建韋恩圖(見(jiàn)圖5)。八河扇貝養(yǎng)殖區(qū)和楮島扇貝養(yǎng)殖區(qū)中浮游生物共分為1 396個(gè)OTUs，其中2個(gè)養(yǎng)殖區(qū)共有物種549個(gè)，約占總浮游生物的39.3%。共有物種中，18S rDNA相對(duì)豐度較高的浮游植物是抑食金球藻(A.anophagefferens)、多形微眼藻(Minutocelluspolymorphus)、假微型海鏈藻(Thalassiosirapseudonana)，分別占總浮游生物的46.33%、12.40%和2.34%。

2.4 浮游生物18S rDNA基因拷貝濃度的定量分析

以質(zhì)粒拷貝濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，qPCR的Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=-3.225x+38.5，其中R2=0.9953，擴(kuò)增效率為104.2%。

八河扇貝養(yǎng)殖區(qū)和楮島扇貝養(yǎng)殖區(qū)中浮游生物總18S rDNA基因拷貝濃度分別為3.59×105和8.62×104copies/mL。18S rDNA相對(duì)豐度大于1%的浮游生物類群主要有海金藻(Pelagophytes)、硅藻(Diatoms)、甲藻(Dinoflagellates)、綠藻(Chlorophytes)、隱藻(Cryptophytes)、軟體動(dòng)物(Mollusca)、有孔蟲(Foraminifera)和纖毛蟲(Ciliophora)，其18S rDNA基因拷貝濃度如圖6所示。在八河扇貝養(yǎng)殖區(qū)，硅藻的18S rDNA拷貝濃度最高，為1.40×105copies/mL，其次是海金藻和軟體動(dòng)物，其濃度分別為7.06×104和4.04×104copies/mL；在楮島扇貝養(yǎng)殖區(qū)，則是海金藻的18S rDNA拷貝濃度最高，為6.30×104copies/mL，其次是隱藻和綠藻，其濃度分別為1.66×103和1.58×103copies/mL。

圖5 采樣站位樣品中OTUs分布韋恩圖Fig.5 Venn diagram showing the unique and shared OTUs in samples

圖6 18S rDNA相對(duì)豐度大于1%的微型 浮游生物的18S rDNA基因拷貝濃度

3 討論

浮游植物是海洋生態(tài)系統(tǒng)中重要的初級(jí)生產(chǎn)者和能量轉(zhuǎn)換者，其種類和數(shù)量的改變會(huì)引起海洋食物鏈發(fā)生變化，對(duì)浮游動(dòng)物和魚蝦等海洋生物的生長(zhǎng)產(chǎn)生重大影響，甚至導(dǎo)致整個(gè)海洋生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變；浮游動(dòng)物在海洋食物網(wǎng)中起著承上啟下的作用，既可以作為消費(fèi)者捕食浮游植物，又是上一級(jí)消費(fèi)者(如魚、蝦等)的重要餌料，是食物鏈的重要組成部分。浮游生物群落的多樣性對(duì)其生存的海洋生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定起著非常重要的作用。在本研究中，運(yùn)用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)威海榮成臨近海域八河扇貝養(yǎng)殖區(qū)和楮島扇貝養(yǎng)殖區(qū)的微型浮游生物群落組成進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示，在浮游植物種類組成上，2個(gè)樣品中共檢測(cè)到22個(gè)綱，其中海金藻、硅藻、綠藻、甲藻和隱藻是主要類群(見(jiàn)圖4a)，海金藻抑食金球藻和硅藻多形微眼藻是18S rDNA相對(duì)豐度較高的物種(見(jiàn)圖5)；在浮游動(dòng)物種類組成上，兩個(gè)樣品中共檢測(cè)到16個(gè)門，在八河扇貝養(yǎng)殖區(qū)18S rDNA相對(duì)豐度較高的浮游動(dòng)物是軟體動(dòng)物、有孔蟲和纖毛蟲，而在楮島扇貝養(yǎng)殖區(qū)則是環(huán)節(jié)動(dòng)物的18S rDNA相對(duì)豐度較高(見(jiàn)圖4b)。與顯微鏡觀察計(jì)數(shù)相比，高通量測(cè)序技術(shù)在浮游生物群落組成與多樣性研究方面，節(jié)約了大量人力、物力，不會(huì)遺漏一些個(gè)體較小或豐度較低的物種，為快速、準(zhǔn)確、全面地分析浮游生物群落組成提供了高效可行的檢測(cè)方法。

八河扇貝養(yǎng)殖區(qū)和楮島扇貝養(yǎng)殖區(qū)的浮游生物群落結(jié)構(gòu)有較大差異。浮游植物方面，在八河扇貝養(yǎng)殖區(qū)，18S rDNA相對(duì)豐度最高的是硅藻，約為39.04%，其次是海金藻、綠藻、甲藻和隱藻；而在楮島扇貝養(yǎng)殖區(qū)，18S rDNA相對(duì)豐度最高的則是海金藻，約為73.07%，其次是隱藻、綠藻和硅藻。浮游動(dòng)物方面，在八河扇貝養(yǎng)殖區(qū)，18S rDNA相對(duì)豐度最高的是軟體動(dòng)物，其次是有孔蟲和纖毛蟲；而在楮島扇貝養(yǎng)殖區(qū)，18S rDNA相對(duì)豐度最高的則是環(huán)節(jié)動(dòng)物，其次是絲足蟲和纖毛蟲。八河扇貝養(yǎng)殖區(qū)和楮島扇貝養(yǎng)殖區(qū)的浮游生物群落結(jié)構(gòu)存在較大差異的原因可能與當(dāng)?shù)睾Ｓ虻沫h(huán)境條件如溫度、鹽度及營(yíng)養(yǎng)鹽條件有關(guān)。一方面，扇貝養(yǎng)殖會(huì)使水體中的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量增加，養(yǎng)殖密度及養(yǎng)殖規(guī)模的不同會(huì)導(dǎo)致兩個(gè)區(qū)域的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量存在差異。另一方面，2011年7月榮成共有12場(chǎng)降雨，平均兩天一場(chǎng)，榮成最大的水庫(kù)——八河水庫(kù)在6月26日首次開(kāi)閘泄洪以來(lái)，7月份又有3次泄洪，八河水庫(kù)在泄洪時(shí)將淡水排入桑溝灣，八河扇貝養(yǎng)殖區(qū)中有機(jī)營(yíng)養(yǎng)鹽和無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)鹽的濃度因淡水的輸入均會(huì)降低；桑溝灣楮島沿岸有大葉藻海草床分布，大葉藻生長(zhǎng)過(guò)程中吸收利用環(huán)境中的無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)鹽，影響楮島扇貝養(yǎng)殖區(qū)無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)鹽含量，因此，兩個(gè)區(qū)域的營(yíng)養(yǎng)鹽含量及組成可能存在差異，進(jìn)而導(dǎo)致兩個(gè)海域中浮游植物群落結(jié)構(gòu)不同，浮游植物群落結(jié)構(gòu)的不同又會(huì)通過(guò)影響浮游動(dòng)物攝食而改變其群落結(jié)構(gòu)。

在八河扇貝養(yǎng)殖區(qū)，硅藻的18S rDNA拷貝濃度最高，達(dá)到1.40×105copies/mL，其中，多形微眼藻為8.46×104copies/mL，約占硅藻總拷貝數(shù)的60.44%，其次是抑食金球藻，約為7.06×104copies/mL；在楮島扇貝養(yǎng)殖區(qū)，則抑食金球藻的18S rDNA拷貝濃度最高，約為6.30×104copies/mL，其次是多形微眼藻，約為1.07×103copies/mL。于杰等通過(guò)對(duì)2011年渤海海域褐潮期微型浮游生物多樣性研究發(fā)現(xiàn)，褐潮可能是由抑食金球藻和多形微眼藻兩種浮游植物共同形成的[27]。Qiao等通過(guò)研究2013年秦皇島海域褐潮暴發(fā)過(guò)程中優(yōu)勢(shì)種的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化，同樣發(fā)現(xiàn)抑食金球藻可以與多形微眼藻共存[4]。

抑食金球藻的18S rDNA拷貝濃度之所以較高，一方面與其營(yíng)養(yǎng)鹽利用特性有關(guān)。大量研究表明，抑食金球藻可以吸收利用溶解性有機(jī)物中的碳、氮、磷[30]。通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，抑食金球藻褐潮暴發(fā)時(shí)，海水中溶解有機(jī)氮(Dissolved organic nitrogen, DON)含量會(huì)隨著抑食金球藻細(xì)胞密度的增加而降低[31]，且與未暴發(fā)抑食金球藻褐潮的海域相比，暴發(fā)該種褐潮的海域中DON濃度較高[32-33]。Dong等通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，抑食金球藻在硝酸鹽和尿素同時(shí)作為氮源的培養(yǎng)條件下，主要吸收利用尿素，而不是硝酸鹽[34]。楮島周邊水產(chǎn)養(yǎng)殖較為發(fā)達(dá)，養(yǎng)殖密集，濾食性貝類的代謝產(chǎn)物不能被微生物及時(shí)分解利用，從而使養(yǎng)殖水體中的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量增加；另外，濾食性貝類的生物沉降使養(yǎng)殖海區(qū)底部滯留豐富的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這些有機(jī)物經(jīng)微生物礦化作用和再懸浮后再次進(jìn)入水體營(yíng)養(yǎng)鹽循環(huán)[35]，這就為抑食金球藻褐潮的暴發(fā)提供了營(yíng)養(yǎng)支持。此外，密集的海水養(yǎng)殖使水體中的顆粒物含量增加，導(dǎo)致水體透明度下降，進(jìn)而影響光的透射率。研究發(fā)現(xiàn)，與自養(yǎng)藻類相比，抑食金球藻更能適應(yīng)低光照環(huán)境[36]，一方面可能是因?yàn)樵撛迥軌蛑苯永萌芙庥袡C(jī)碳中的碳元素[37]，另一方面，與其它競(jìng)爭(zhēng)藻類相比，抑食金球藻含有更多與捕獲光相關(guān)的基因[38]。因此，抑食金球藻這種可以高效利用有機(jī)營(yíng)養(yǎng)鹽以及適應(yīng)低光照的能力使其比其他自養(yǎng)藻類更具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。

抑食金球藻的18S rDNA拷貝濃度較高的另一個(gè)原因可能與其攝食壓有關(guān)。有研究表明，濾食性雙殼類可以通過(guò)下行控制作用對(duì)浮游植物產(chǎn)生影響，進(jìn)而改變水體中浮游植物群落結(jié)構(gòu)[39-40]。抑食金球藻個(gè)體微小，直徑約為2 μm[41]，與這類較小的微微型浮游生物(直徑小于3 μm)相比，較大的微型浮游生物更容易被雙殼類攝食[40]。Gobler等的研究發(fā)現(xiàn)在褐潮暴發(fā)過(guò)程中，小型浮游動(dòng)物更喜歡攝食其他浮游植物而不是抑食金球藻[42]。此外，抑食金球藻細(xì)胞外的胞外多糖層也會(huì)抑制貝類攝食[43-44]。因此，攝食壓的降低促進(jìn)了抑食金球藻褐潮暴發(fā)。

多形微眼藻細(xì)胞直徑約為2.5～3.5 μm[45]，實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，多形微眼藻能降低海灣扇貝幼體的生長(zhǎng)率和成體的產(chǎn)卵率[45]，導(dǎo)致貽貝的清除率降低[46]。多形微眼藻與抑食金球藻細(xì)胞大小相近，都能抑制海灣扇貝的生長(zhǎng)，與褐潮暴發(fā)過(guò)程中觀察到的海灣扇貝幼蟲的滯長(zhǎng)現(xiàn)象一致。Smayda和Villareal在納拉甘西特灣褐潮研究中同樣發(fā)現(xiàn)這兩種藻可大量共存[47]。為研究抑食金球藻與多形微眼藻之間的競(jìng)爭(zhēng)作用，將二者的培養(yǎng)液按不同比例(1%～99%)混合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑食金球藻對(duì)多形微眼藻的生長(zhǎng)并沒(méi)有明顯的抑制作用[48]，這可能是抑食金球藻褐潮暴發(fā)時(shí)多形微眼藻能與之共存的原因之一。另外，兩種藻的營(yíng)養(yǎng)鹽利用特性也有差異，以谷氨酸和尿素為唯一氮源分別對(duì)2種微藻進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑食金球藻對(duì)谷氨酸和尿素的吸收利用能力要高于多形微眼藻[49]。目前，有關(guān)多形微眼藻的營(yíng)養(yǎng)鹽利用情況，可供參考的文獻(xiàn)資料較少，該方面還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，榮成扇貝養(yǎng)殖區(qū)18S rDNA相對(duì)豐度較高的物種是抑食金球藻和多形微眼藻。抑食金球藻18S rDNA的拷貝濃度較高，表明該養(yǎng)殖區(qū)有暴發(fā)褐潮的可能。因此，為保證榮成海域扇貝養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展，應(yīng)當(dāng)采取有效措施預(yù)防褐潮暴發(fā)。一方面，需要提高養(yǎng)殖技術(shù)并加強(qiáng)對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境的管理，如合理確定養(yǎng)殖面積與養(yǎng)殖密度，改進(jìn)投餌方式，減少殘餌量，提高水體循環(huán)與自凈能力等；另一方面，建立貝藻混養(yǎng)綜合生態(tài)養(yǎng)殖模式，利用海帶、江蘺、龍須菜、孔石莼等大型海藻吸收和去除扇貝排泄的氮、磷，控制水體富營(yíng)養(yǎng)化，改善扇貝養(yǎng)殖海區(qū)的水體環(huán)境質(zhì)量；此外，還要加強(qiáng)對(duì)養(yǎng)殖海區(qū)的監(jiān)測(cè)力度，特別對(duì)個(gè)體微小的多形微眼藻、抑食金球藻建立高效有效的檢測(cè)方法(如定量PCR、抗體檢測(cè)技術(shù)等)。通過(guò)對(duì)養(yǎng)殖海區(qū)進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)，建立養(yǎng)殖海域浮游生物種質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建褐潮預(yù)警預(yù)報(bào)模型，制定應(yīng)急預(yù)案，以保障海水養(yǎng)殖健康發(fā)展。

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CharacteristicsofEukaryoticNanoplanktonCommunityintheScallopCultureAreaofRongchengbyIlluminaSequencing

QIAO Ling1, 2, 3, YU Jie4, LI Ying1, 2, 3, ZHEN Yu1, 2, 3, MI Tie-Zhu1, 2, 3, ZHANG Ling-Ling4, 5, BAO Zhen-Min4, 5

(1. Key Laboratory of Marine Environment and Ecology, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266100, China; 2. College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China; 3. Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China; 4. Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding (Ocean University of China), Ministry of Education, Qingdao 266003, China; 5. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China)

Plankton community structures in samples collected from the scallop culture area of Bahe and Chudao in July, 2011 were analyzed using Illumina sequencing. The results showed that 22 classes of phytoplankton (Pelagophyceae, Mediophyceae, Coscinodiscophyceae, Dinophyceae, Mamiellophyceae, Cryptophyceae, Trebouxiophyceae, Haptophyceae, Chrysophyceae, Bolidophyceae, Ulvophyceae, Chlorophyceae, Raphidophyceae, Synurophyceae, Nephroselmidophyceae, Katablepharidaceae, Dictyochophyceae, Eustigmatophyceae, Bacillariophyceae, Chlorodendrophyceae, Florideophyceae and Prasinophyceae) and 16 phyla of zooplankton (Mollusca, Foraminifera, Ciliophora, Euglenozoa, Annelida, Cercozoa, Chordata, Cnidaria, Amoebozoa, Porifera, Apicomplexa, Arthropoda, Bryozoa, Apusozoa, Entoprocta and Nemertea) were detected in the scallop culture area of Bahe and Chudao. For phytoplankton,pelagophytes, diatoms, chlorophytes,dinoflagellates and cryptophytes were the main groups. For zooplankton, Mollusca, Foraminifera and Ciliophora were dominant in Bahe scallop culture area;however,the relative abundance of 18S rDNA from Annelida was higher than others in Chudao scallop culture area. In the scallop culture area of Bahe, the 18S rDNA copy concentration of diatoms was highest, andMinutocelluspolymorphusaccounted for 60.44% of diatoms.Aureococcusanophagefferenswas the second dominant phytoplankton. In the scallop culture area of Chudao, the 18S rDNA copy concentration ofA.anophagefferenswas highest, followed byM.polymorphus.M.polymorphusandA.anophagefferenswere dominant species in the scallop culture area of Rongcheng. The results indicated that there was the possibility of brown tides breaking out in the scallop culture area of Rongcheng.Some effective measures should be taken to prevent the outbreak of brown tides.

Aureococcusanophagefferens;Minutocelluspolymorphus; 18S rDNA gene; high-throughput sequencing

Q178.53

A

1672-5174(2018)02-064-09

10.16441/j.cnki.hdxb.20160399

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海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201205031)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41521064)；青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室鰲山科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(2016ASKJ02)資助

Supported by the Public Science and Technology Research Funds Projects of Ocean (201205031); the National Natural Science Foundation of China (41521064); the Scientific and Technological Innovation Project of the Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology (2016ASKJ02)

2016-12-14；

2017-02-09

喬玲(1991-)，女，博士生，研究方向?yàn)楹殖北┌l(fā)過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)鹽特征及浮游植物群落結(jié)構(gòu)研究。E-mail：qiaoling1990123@126.com

? ? 通訊作者：E-mail：zhenyu@ouc.edu.cn

責(zé)任編輯 高 蓓