陸敏 ，常曉婕 ，張文晉 ，2，劉寧 ，2，楊佳美 ，2，劉艷華 ，2，馬學(xué)琴 ，2，楊建宏 ，2，余建強(qiáng) ，2，李鳳梅 ，2

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，寧夏銀川 750004）（2.寧夏回藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心,寧夏回醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心,寧夏藥物創(chuàng)新與仿制藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川 750004）

隨著人民生活水平的提高以及人們不良生活習(xí)慣的影響，高脂血癥的發(fā)生率呈逐年上升的趨勢(shì)，據(jù)2012年全國(guó)調(diào)查[1,2]結(jié)果顯示，中國(guó)成人血脂異?？傮w患病率高達(dá) 40.4%，其中，高低密度脂蛋白血癥患病率為33.9%；高甘油三酯血癥為13.1%；高膽固醇血癥為4.9%。

血脂[3,4]是對(duì)血漿中所含脂類(lèi)的統(tǒng)稱(chēng)，主要包括三酰甘油（TG）、膽固醇及其酯（即總膽固醇，TC）、磷脂（PL）以及游離脂肪酸（FFA）等，這些脂類(lèi)與血漿中的載脂蛋白結(jié)合形成乳糜微粒[5]（CM）、極低密度脂蛋白（VLDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）和高密度脂蛋白（HDL-C），在血漿中運(yùn)輸和代謝。當(dāng)機(jī)體在一些內(nèi)外因素的作用下發(fā)生脂質(zhì)代謝異常，主要表現(xiàn)為L(zhǎng)DL水平升高和HDL水平降低時(shí)，導(dǎo)致血脂水平升高并超過(guò)正常值，即為高脂血癥（hyperlipidemia）。高脂血癥是中老年人群的多發(fā)疾病，可引起多種嚴(yán)重并發(fā)癥，包括動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、腦卒中等一系列心腦血管疾病，這些疾病都是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的主要原因[6]。

研究表明，枸杞可有效降低血清中 TG、TC、LDL-C含量及LDL-C/HDL-C(高密度脂蛋白)比值，具有明顯的降血脂作用[7]；仙人掌可降低高脂血癥小鼠血清TC、TG含量及AI水平，明顯升高HDL-C含量[8,9]；胡蘆巴能顯著降低大鼠血清TG、TC、LDL-C水平[10]。關(guān)于枸杞、仙人掌和葫蘆巴這三種植物的復(fù)方，還未見(jiàn)報(bào)道，寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院首次將這三種植物進(jìn)行科學(xué)組方，通過(guò)制備工藝研究出香杞平脂咀嚼片（Xiang Qi Lower Blood Lipids Chewable Tablet），已經(jīng)完成含量測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)的目的旨在通過(guò)建立高脂血癥小鼠模型，初步探究香杞平脂咀嚼片對(duì)實(shí)驗(yàn)性高脂血癥小鼠的預(yù)防作用，為開(kāi)發(fā)新的平脂產(chǎn)品提供支持，同時(shí)也為香杞平脂咀嚼片合理使用提供初步指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 原料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及高脂飼料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)健康雄性小鼠60只，體重22±2 g，購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（寧）-2016-0001。

高脂飼料配方：膽固醇 1.0%、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物預(yù)混料2.0%、磷酸氫鈣 2.0%、大豆分離蛋白 10.0%、豬油12.0%、蔗糖20.0%、維持鼠料53.0%，購(gòu)于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司。

1.1.2 藥物、主要試劑及儀器

香杞平脂咀嚼片，寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院聯(lián)合寧夏回藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心共同研制，所用輔料皆為食品級(jí)別；辛伐他汀片，國(guó)藥集團(tuán)汕頭金石制藥有限公司（171101，20 mg/片）；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，天津光復(fù)精細(xì)化工有限公司；生理鹽水，山東齊都藥業(yè)有限公司；總膽固醇(TC)試劑盒、甘油三酯(TG) 試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒都購(gòu)自南京建成生物工程研究所；AL104電子天平，METTLER TOLEDO；TD5K低速離心機(jī)，長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器公司；酶標(biāo)儀，THermo 1510-00655C；DK-S24型恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司；其余試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 香杞平脂咀嚼片的制備

采用濕法制粒，將枸杞子提取物、仙人掌提取物、葫蘆巴提取物（由于主藥具有強(qiáng)吸潮性，要保證制粒車(chē)間的溫濕度不宜過(guò)高）與β環(huán)糊精等輔料按比例混合均勻，使用75%乙醇進(jìn)行制軟材，過(guò)14目篩，50 ℃干燥2 h，整粒，添加1%硬脂酸鎂混合均勻后壓片得到香杞平脂咀嚼片。

1.2.2 香杞平脂咀嚼片最大耐受量的測(cè)定

采用一次最大限量法，SPF級(jí)ICR (20±2) g小鼠40只，雌、雄各半，適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境2～3 d。禁食不禁水12 h后，隨機(jī)挑選20只(雌、雄各半)按給藥量2 g/kg，給藥體積0.4 mL/10 g經(jīng)口一次給藥，另20只給予同體積的蒸餾水，連續(xù)觀察7 d，記錄小鼠的毛發(fā)、中毒癥狀及死亡情況。

1.2.3 動(dòng)物分組及給藥

選用健康雄性SPF級(jí)ICR小鼠(22±2) g，60只，于適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組，以下簡(jiǎn)稱(chēng)正常組；模型組；模型+辛伐他汀組；模型+香杞平脂咀嚼片（2 g/kg、1 g/kg、0.5 g/kg）劑量組，以下簡(jiǎn)稱(chēng)香杞片高、中、低劑量組；于實(shí)驗(yàn)前一天給小鼠禁食不禁水12 h，于每天早晨8:00～9:00灌胃給藥。除正常組飼喂普通飼料外，其余各組均飼喂高糖高脂飼料。同時(shí)，給藥組每日分別灌胃香杞片 2 g/kg、1 g/kg、0.5 g/kg（溶劑用生理鹽水）；辛伐他汀5 mg/kg（溶劑用0.5% CMC-Na溶液），正常組和模型組每日給予同體積生理鹽水，每次用藥體積均按0.2 mL/10 g計(jì)算，各組灌胃1次/d，連續(xù)灌胃6周。每周記錄一次小鼠體重，觀察飲食對(duì)小鼠體重的影響。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定

每周記錄一次小鼠體重。末次給藥禁食不禁水12 h后各組小鼠摘除眼球取血，4 ℃冰箱靜置30 min后將血樣低溫離心，3500 r/min，離心15 min，分離血清，密封，-20 ℃冷存待檢。采用試劑盒檢測(cè)血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST水平。

1.2.4.1 血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量的檢測(cè)

按照生化指標(biāo)測(cè)試試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，所有小鼠血清檢測(cè)過(guò)程避免反復(fù)凍融和長(zhǎng)時(shí)間保存降低酶活力，在取樣當(dāng)天即開(kāi)始檢測(cè)，若樣品蛋白濃度過(guò)高，必要時(shí)做適當(dāng)濃度稀釋后測(cè)定。

磷酸甘油氧化酶法(GPO/PAP酶法)測(cè)定血清中TG含量，在510 nm處測(cè)定吸光度，含量計(jì)算方法如下式（1）；COD/PAP酶法測(cè)定血清中TC含量，在510 nm 處測(cè)定吸光度，含量計(jì)算方法如下式（2）；直接法測(cè)定血清中LDL-C含量，在546 nm處測(cè)定吸光度，含量計(jì)算方法如下式（3）；直接法測(cè)定血清中HDL-C含量，在546 nm處測(cè)定吸光度，含量計(jì)算如下式（4）。

1.2.4.2 血清中ALT、AST活力的檢測(cè)

按照生化指標(biāo)測(cè)試試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，所有小鼠血清檢測(cè)過(guò)程避免反復(fù)凍融和長(zhǎng)時(shí)間保存降低酶活力，在取樣后立即開(kāi)始檢測(cè)。

微板法測(cè)定血清中ALT活力，嚴(yán)格按照試劑盒操作進(jìn)行，先做ALT標(biāo)準(zhǔn)曲線，在510 nm測(cè)定各孔OD值，各孔吸光度減零孔吸光度，所得差值等于絕對(duì)OD值（=測(cè)定孔OD值-對(duì)照孔OD值）作為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的卡門(mén)氏單位為縱坐標(biāo)，作坐標(biāo)圖擬合公式；按試劑盒操作在510 nm處測(cè)定各孔OD值，以絕對(duì)OD值為最終數(shù)值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得相應(yīng)的ALT活力單位。

微板法測(cè)定血清中AST活力，嚴(yán)格按照試劑盒操作進(jìn)行，先做AST標(biāo)準(zhǔn)曲線，在510 nm測(cè)定各孔OD值，各孔吸光度減零孔吸光度，所得差值等于絕對(duì)OD值（=測(cè)定孔OD值-對(duì)照孔OD值）作為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的卡門(mén)氏單位為縱坐標(biāo)，作坐標(biāo)圖擬合公式；按試劑盒操作在510 nm處測(cè)定各孔OD值，以絕對(duì)OD值為最終數(shù)值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得相應(yīng)的AST活力單位。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，“n”表示“每組小鼠只數(shù)”，采用單因素方差分析（One-way-anova）多組均數(shù)間的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以p<0.05判斷為有顯著性差異，p<0.01為有極顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 香杞平脂咀嚼片最大耐受量的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)期間小鼠無(wú)任何不良癥狀，飲食、飲水、毛發(fā)及活動(dòng)均正常，且未出現(xiàn)死亡，根據(jù)最大耐受量的判定，給予小鼠藥物的最大溶解度和最大給藥體積時(shí)小鼠未出現(xiàn)死亡的情況下，最大耐受量大于最大給藥量，則小鼠對(duì)香杞平脂咀嚼片的最大耐受量大于 2 g/kg。

2.2 香杞平脂咀嚼片對(duì)高脂血癥小鼠體重影響

整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)各組小鼠增加的體重在 18～19 g不等，各組間沒(méi)有差異（p>0.05），說(shuō)明在給藥期間各組小鼠生長(zhǎng)良好，給藥行為未對(duì)小鼠造成不良反應(yīng)。香杞平脂咀嚼片對(duì)高脂血癥小鼠體重的影響結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 香杞平脂咀嚼片對(duì)高脂血癥小鼠體重的影響Table 1 Effect of Xiang Qi lower blood lipids chewable tablet on body weight of hyperlipidemia mice (±s, n=10)

表1 香杞平脂咀嚼片對(duì)高脂血癥小鼠體重的影響Table 1 Effect of Xiang Qi lower blood lipids chewable tablet on body weight of hyperlipidemia mice (±s, n=10)

注：與正常組比較，*表示差異有顯著性（p<0.05），**表示差異有極顯著性（p<0.01）；與模型組比較，#表示差異有顯著性（p<0.05），##表示差異有極顯著性（p<0.01）。

組別 增加的體重/g正常組 18.73±3.28模型組 19.24±4.05模型+辛伐他汀(5 mg/kg) 18.31±2.52模型+香杞片(2 g/kg) 18.20±2.75模型+香杞片(1 g/kg) 19.70±3.818模型+香杞片(0.5 g/kg) 18.27±4.13

2.3 香杞平脂咀嚼片對(duì)高脂血癥小鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C的影響

由表2數(shù)據(jù)可知：與正常組相比，模型組TC顯著升高（p<0.05），TG極顯著降低（p<0.01），LDL-C極顯著升高（p<0.01），說(shuō)明此高脂飼料能夠升高TC和LDL-C但是對(duì)HDL-C影響不大，并且降低模型組TG[11]的原因可能是小鼠進(jìn)食脂肪過(guò)多，吸收過(guò)少造成肝損傷。并且香杞片高、中和低劑量組TG與正常組相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05），表明香杞片具有能夠使高脂血癥小鼠TG恢復(fù)正常的作用。與模型組相比，陽(yáng)性藥TC極顯著降低（p<0.01）、LDL-C顯著降低（p<0.05），但陽(yáng)性藥對(duì)TG和HDL-C的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是樣本量過(guò)少的原因。香杞平脂咀嚼片的高、中和低劑量均能降低TC和LDL-C，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01或p<0.05），且高劑量組能夠顯著升高HDL-C（p<0.05），各組對(duì)TC的降低幅度分別為25.75%、28.85%、12.23%，對(duì)LDL-C的降低幅度為37.90%、34.67%、2.42%，對(duì)HDL-C的升高幅度分別為73.70%、17.24%、3.92%。結(jié)果可知香杞平脂咀嚼片能夠有效改善高脂血癥小鼠血脂。

孫國(guó)棟[10]和盧芙蓉等[12]研究的葫蘆巴提取物降低了TG、TC和LDL-C但對(duì)HDL-C無(wú)明顯影響；饒穎竹等[13]對(duì)仙人掌的研究結(jié)果顯示降低了TC、TG，升高HDL-C；韋唯[14]將枸杞和沙棘進(jìn)行復(fù)配制備保健品，其中高劑量組降低TC和TG的幅度分別為25.40%和24.50%，升高HDL-C的幅度為18.70%，與之相比，香杞平脂咀嚼片能夠降低37.90%的LDL-C并能增加73.70%的HDL-C。以上研究結(jié)果顯示葫蘆巴、仙人掌和枸杞分別具有降血脂作用，而本研究將枸杞、仙人掌和葫蘆巴科學(xué)搭配在一起，進(jìn)行取長(zhǎng)補(bǔ)短，研究結(jié)果也顯示香杞平脂咀嚼片能夠多方面調(diào)控血脂。

表2 香杞平脂咀嚼片對(duì)高脂血癥小鼠血脂水平的影響Table 2 Effect of Xiang Qi lower blood lipids chewable tablet on blood lipid levels in hyperlipidemia mice (±s, n=10)

表2 香杞平脂咀嚼片對(duì)高脂血癥小鼠血脂水平的影響Table 2 Effect of Xiang Qi lower blood lipids chewable tablet on blood lipid levels in hyperlipidemia mice (±s, n=10)

注：與正常組比較，*表示差異有顯著性（p<0.05），**表示差異有極顯著性（p<0.01）；與模型組比較，#表示差異有顯著性（p<0.05），##表示差異有極顯著性（p<0.01）。

組別 TG/(mmol/L) TC/(mmol/L) HDL-C/(mmol/L) LDL-C/(mmol/L)正常組 1.29±0.31 4.87±1.48 2.39±0.60 0.52±0.17模型組 0.81±0.17** 10.33±1.44* 2.32±0.60 1.24±0.24**模型+辛伐他汀(5 mg/kg) 0.92±0.20 6.29±1.29## 3.23±1.06 0.79±0.30#模型+香杞片(2 g/kg) 1.01±0.26## 7.67±0.91# 4.01±0.86# 0.77±0.14##模型+香杞片(1 g/kg) 1.04±0.28# 7.35±1.99# 2.72±0.99 0.81±0.37##模型+香杞片(0.5 g/kg) 1.07±0.21# 9.06±0.94 2.10±0.67 1.21±0.63

2.4 香杞平脂咀嚼片對(duì)小鼠肝功能的影響

圖1 香杞平脂咀嚼片對(duì)高脂血癥小鼠AST的影響Fig.1 Effect of Xiang Qi lower blood lipids chewable tablet on Liver Function in Mice with AST (±s, n=10)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，與正常組相比：模型組小鼠血清中ALT、AST明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01或p<0.05），表明長(zhǎng)期飼養(yǎng)此高脂飼料會(huì)對(duì)小鼠的肝臟造成嚴(yán)重?fù)p害。與模型組相比：辛伐他汀組能夠極其顯著的降低 AST和 ALT，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01），表明陽(yáng)性藥辛伐他汀能夠極其有效的保護(hù)肝損傷；而香杞平脂咀嚼片高和中劑量組能夠極顯著降低ALT（p<0.01），各組對(duì)ALT的降低幅度分別為42.09%、39.61%、22.56%，對(duì)AST的降低幅度分別為25.08%、13.68%、6.19%。

圖2 香杞平脂咀嚼片對(duì)高脂血癥小鼠ALT的影響Fig.2 Effect of Xiang Qi lower blood lipids chewable tablet on liver function in mice with ALT (±s, n=10)

研究表明枸杞[15]、仙人掌[16]和葫蘆巴[10]均能夠降低ALT和AST活性，具有保護(hù)肝損傷的作用。但本研究對(duì)AST影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）可能是個(gè)體差異或者樣本數(shù)量過(guò)少導(dǎo)致，表明香杞平脂咀嚼片具有保護(hù)肝的作用。香杞平脂咀嚼片對(duì)高脂血癥小鼠肝功能的影響結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。

3 結(jié)論

3.1 高脂血癥是心腦血管疾病的重要致病因素，臨床資料證實(shí)TG升高1 mmol/L，男性心腦血管疾病危險(xiǎn)性升高14%，女性則升高37%，TC、LDL-C濃度與心腦血管疾病發(fā)病率也呈正相關(guān)，而 HDL-C則與心腦血管疾病的發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)[17]。目前，臨床上主要使用西藥[18,19]進(jìn)行調(diào)節(jié)血脂，這些藥物有一定的降脂作用，但都有較明顯的毒副作用，長(zhǎng)期服用易造成肝臟損傷，因此，西藥的副作用仍是高脂血癥治療中的一大難題。比如說(shuō)，膽汁酸蟹合劑類(lèi)[20]中的考來(lái)烯胺降脂藥，長(zhǎng)期使用可引發(fā)高氯酸血癥，可影響脂溶性維生素（A、D、E、K）、葉酸及其他一些弱酸性藥物的吸收。

3.2 本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)建立高脂血癥小鼠模型，采用辛伐他汀作為陽(yáng)性對(duì)照藥，探究采用預(yù)防治療的方法，驗(yàn)證香杞平脂咀嚼片在高脂飲食過(guò)程中對(duì)血脂的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)研究表明，高糖高脂飲食干預(yù)只引發(fā)了血清中TC的升高，且差異有顯著性（p<0.01），TG并未升高，則該實(shí)驗(yàn)復(fù)制的模型為高膽固醇血癥模型。研究結(jié)果表明香杞平脂咀嚼片能降低高脂血癥小鼠血清中TC、LDL-C，提高小鼠血清中HDL-C水平，緩解體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，有效抑制脂質(zhì)在肝臟和動(dòng)脈壁沉積。高脂血癥還可并發(fā)肝臟損傷，轉(zhuǎn)氨酶[21]是反映肝臟功能的一項(xiàng)指標(biāo)，其中ALT和AST是最能反映其損傷程度的兩個(gè)酶活性指標(biāo)，轉(zhuǎn)氨酶是人體代謝過(guò)程中必不可少的“催化劑”，主要存在于肝細(xì)胞中，當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生炎癥、壞死、中毒等，造成肝細(xì)胞受損時(shí)，轉(zhuǎn)氨酶便會(huì)釋放入血液里，使血清轉(zhuǎn)氨酶升高。本實(shí)驗(yàn)研究表明，6周高糖高脂飲食并使得血清中ALT、AST轉(zhuǎn)氨酶升高，可見(jiàn)已經(jīng)造成肝細(xì)胞損傷，各組ALT、AST活力的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05或p<0.01），然而喂養(yǎng)了香杞平脂咀嚼片的高脂血癥的小鼠轉(zhuǎn)氨酶活力明顯降低，證明其具有保護(hù)肝細(xì)胞的作用。

3.3 美國(guó)國(guó)家膽固醇教育計(jì)劃[22]第 3次報(bào)告所提出的血脂異常防治建議方案中，均強(qiáng)調(diào)在藥物治療前，應(yīng)先進(jìn)行3～6個(gè)月的非藥物治療，主要手段包括改變不良生活方式、飲食調(diào)節(jié)、戒煙酒及運(yùn)動(dòng)鍛煉等措施。香杞平脂咀嚼片從保健品的理念出發(fā)，旨在通過(guò)長(zhǎng)期服用來(lái)預(yù)防高脂血癥，避免動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，從而降低心血管疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。目前針對(duì)香杞平脂咀嚼片的研究還不是很廣泛，但這是我們未來(lái)的研究方向，旨在通過(guò)食療控制疾病的發(fā)生，提高人們的生活質(zhì)量。