肖玉潔 李澤明 易鵬飛 胡日生 張先文 朱列書

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙 410128；2. 中國煙草中南農(nóng)業(yè)試驗站，長沙 410004；3. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128）

植物受多種非生物脅迫影響，低溫是影響植物生長發(fā)育以及地理分布的主要限制因素。低溫刺激導(dǎo)致植物體內(nèi)的各生理代謝活動紊亂，表型上產(chǎn)生一系列的生理變化如苗期早花，植株矮小等。相關(guān)研究表明轉(zhuǎn)錄因子在植物信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用，轉(zhuǎn)錄因子可以通過識別下游基因啟動子上的功能元件來激活或者抑制目標(biāo)基因表達，引起植物體內(nèi)的低溫相關(guān)代謝途徑產(chǎn)生變化，從而改變植物對于外界低溫脅迫刺激的適應(yīng)能力［1-3］。本文著重從轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控低溫脅迫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達過程來分析植物體內(nèi)的抗低溫轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進一步揭示在低溫逆境條件下的相關(guān)基因的表達調(diào)控機理，為今后的逆境研究工作提供了眾多線索與依據(jù)。

1 轉(zhuǎn)錄因子在低溫脅迫中的研究

轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是植物對低溫脅迫反應(yīng)的關(guān)鍵部分。目前，參與低溫信號響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子有AP2/ERF、NAC、WRKY、MYB、bZIP 和 ZFPs等［4］。每個轉(zhuǎn)錄因子基本包含4個獨立的結(jié)構(gòu)域，即DNA結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄功能域、核定位信號和寡聚化位點［5］，轉(zhuǎn)錄因子在表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的主要功能由其轉(zhuǎn)錄功能域決定。

1.1 AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子在低溫脅迫中的研究

1.1.1 AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族 低溫誘導(dǎo)AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子表達，激活或抑制下游低溫響應(yīng)基因表達［6］。AP2/ERF家族成員分為AP2、RAV、ERF和DREB四類，DREBs和ERFs轉(zhuǎn)錄因子家族是AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族最重要的亞家族。ERF轉(zhuǎn)錄因子可以直接結(jié)合下游基因啟動子上的GCC盒（GCCGCC）調(diào)控其表達。在番茄中發(fā)現(xiàn)了ERF家族基因TERF2和LeERF2，過表達或敲除TERF2/LeERF2可以增強或減弱蕃茄低溫耐受力［7］。有研究表明，DREB/CBF途徑是植物中公認的關(guān)鍵的低溫信號調(diào)節(jié)通路，DREB轉(zhuǎn)錄因子通過識別與結(jié)合低溫響應(yīng)基因的啟動子上順式作用元件（A/GCCGAC）激活其表達［8］。同時ICE-CBF通路又是DREB/CBF反應(yīng)途徑中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)通路，ICE基因可以結(jié)合CBF基因啟動子上的MYC元件（CACATG）調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄表達［9］。相關(guān)研究表明，當(dāng)植物接收到低溫信號時，CBF基因受到ICE的刺激表達上調(diào)，直接結(jié)合低溫調(diào)節(jié)基因啟動子上的CRT/DRE順式元件，引起低溫響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和后續(xù)合成的蛋白質(zhì)產(chǎn)量的增多［10］。

在草地禾中發(fā)現(xiàn)的PpCBF3只接收低溫刺激，在擬南芥中過表達PpCBF3增強了自身的耐低溫性［11］。在麻風(fēng)樹基因組克隆得到JcCBF2，RT-PCR結(jié)果表明，JcCBF2在低溫脅迫早期快速調(diào)節(jié)低溫響應(yīng)基因，過表達植株的葉片對于低溫耐受力比野生型更好［12］。小麥TaDREB2和TaDREB3在大麥中表達，明顯增強了大麥的耐低溫能力，LEA/COR/DHN的表達量也明顯上調(diào)［13］。在玉米中發(fā)現(xiàn)的2個同源基因ZmDREB1A和ZmDREB2A也參與了植物體內(nèi)的低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［14］。在水稻日本晴中發(fā)現(xiàn)了DREB基因OsDREB6，酵母單雜交分析表明，OsDREB6特異結(jié)合CRT/DRE順式結(jié)合元件激活轉(zhuǎn)錄調(diào)控，過表達OsDREB6增強轉(zhuǎn)基因水稻低溫耐性，發(fā)現(xiàn)RNA干擾型比野生型對于低溫更敏感［15］。

1.1.2 NAC轉(zhuǎn)錄因子家族 NAC參與調(diào)節(jié)植物的發(fā)育過程和環(huán)境脅迫應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子［16］。NAC家族基因包括了N末端高度保守的DNA結(jié)合域和C末端可變的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)［16-17］。在擬南芥中已被證實NAC蛋白通過識別并結(jié)合核心序列（CGTG/A）調(diào)控下游低溫脅迫相關(guān)基因的表達［18］。轉(zhuǎn)基因擬南芥過表達TaNAC2提高植物自身的耐低溫能力［19］。AtLOV1通過激活COR15A和KIN1的表達增強擬南芥的耐低溫性［20］。過表達SINAC1提高馬鈴薯的耐低溫能力，同時檢測到體內(nèi)的CBF基因表達量上調(diào)，ROS積累量減少［21］。番茄NAC轉(zhuǎn)錄因子SINAM1轉(zhuǎn)入煙草，可以提高其自身耐低溫能力，說明SINAM1的表達增強了植物的耐低溫性［10］。低溫時，葡萄體VaNAC26表達上調(diào)［22］。以上研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子參與低溫代謝途徑的調(diào)控，而且多數(shù)基因具有正向調(diào)節(jié)作用。

1.1.3 WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族 WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是最大的高等植物轉(zhuǎn)錄因子家族。它可以結(jié)合目標(biāo)基因啟動子上的作用元件W-BOX（TGACCA/T），調(diào)控下游目的基因表達，從而調(diào)節(jié)植物低溫應(yīng)激反應(yīng)。WRKY轉(zhuǎn)錄因子編碼的蛋白質(zhì)通常表現(xiàn)為抑制作用，低溫處理后下游靶基因表達量下調(diào)［23］。AtWRKY34在花粉中特異性表達，在低溫處理后基因表達量上調(diào)并且反向調(diào)節(jié)擬南芥成熟花粉低溫敏感性［24］。水稻OsWRKY45和OsWRKY76被證明在植物低溫應(yīng)激反應(yīng)過程中行使功能［25-26］。過表達黃瓜CsWRKY46的擬南芥低溫耐受性增強，體內(nèi)脯氨酸含量增加，丙二醛含量減少，電解質(zhì)滲漏水平降低，說明CsWRKY46是植物提高低溫耐受能力的正向調(diào)節(jié)因子［27］。有研究表明茶樹CsWRKY2表達水平受ABA和低溫調(diào)控。低溫刺激下，外源ABA引起CsWRKY2表達量上調(diào)，表明CsWRKY2通過參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑響應(yīng)低溫脅迫［28］。

1.1.4 MYB轉(zhuǎn)錄因子家族 MYB轉(zhuǎn)錄因子家族是目前基因數(shù)最為龐大的植物轉(zhuǎn)錄因子家族。根據(jù)其結(jié)構(gòu)內(nèi)保守的DNA結(jié)合域（MYB結(jié)構(gòu)域）命名。MYB結(jié)合元件（TAACTG）是MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合目的基因的核心序列［29］。AtMYBC1在CBF通路中減弱植物低溫耐受力［30］。OsMYB4受低溫信號刺激表達，轉(zhuǎn)OsMYB4擬南芥對低溫脅迫具有較強耐受力［31］。HOS10編碼重要的脅迫反應(yīng)協(xié)調(diào)因子OsMYB2蛋白［32］。擬南芥 MYB 基因AtRVE1負向調(diào)節(jié)植物的低溫耐受能力［33］。擬南芥MYB15可以結(jié)合CBF3基因啟動子上的作用元件并且抑制其表達［34］。過表達煙草MdSIMYB1可以增強煙草的耐低溫性［35］。梨PcMYB10正向誘導(dǎo)低溫狀態(tài)下花青素的合成［36］。以上結(jié)果表明，該轉(zhuǎn)錄因子家族成員能夠較為明顯提高植物低溫耐能力。

1.1.5 bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族 bZIP轉(zhuǎn)錄因子在低溫脅迫中扮演重要的角色。bZIP蛋白的保守序列（PYCGTGG）可以特異性結(jié)合目標(biāo)基因啟動子上的ABRE元件（ACGT）調(diào)控下游低溫響應(yīng)基因表達［37-38］。水稻OsbZIP52被證實參與低溫脅迫調(diào)控，酵母雙雜交試驗證明OsbZIP52通過識別并結(jié)合下游目標(biāo)基因啟動子上的G-BOX激活其轉(zhuǎn)錄表達，同時證明過表達OsbZIP52可以增強水稻自身低溫敏感性［39-41］。在大豆中發(fā)現(xiàn)的bZIP基因被命名為GmbZIPs，在擬南芥中分別過表達GmbZIP44、GmbZIP46、GmbZIP62和GmbZIP78，擬南芥的耐低溫能力均被增強［42］。CsbZIP6是茶樹低溫應(yīng)激反應(yīng)的負調(diào)控因子，導(dǎo)致下游低溫響應(yīng)基因表達量下調(diào)并且影響茶樹對ABA的敏感性［43］。擬南芥基因AtbZIP1結(jié)合ABRE作用元件，通過ABA依賴的信號傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)植物的低溫脅迫應(yīng)答［44］，表明bZIP轉(zhuǎn)錄因子通過ABA依賴途徑調(diào)控植物低溫脅迫應(yīng)激。

1.1.6 ZFPs轉(zhuǎn)錄因子家族 ZFPs構(gòu)成真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的最大家族之一，家族成員均包含保守的鋅指結(jié)構(gòu)域（QALGGH）。C2H2鋅指蛋白是植物體內(nèi)基因?qū)Φ钟瓦m應(yīng)脅迫環(huán)境的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄阻遏物。在矮牽牛中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子ZPT2-2，包含了2個C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域和一個轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域，低溫處理后該基因在葉片的表達量明顯上調(diào)［45］。大豆基因SCOF-1具有提高轉(zhuǎn)基因植物的抗低溫能力的積極作用［46］。在大豆中新發(fā)現(xiàn)的GmZF1蛋白，擬南芥中過表達GmZF1激活下游COR6.6的表達，提高轉(zhuǎn)基因植株的耐低溫能力［47］，由此證明GmZF1是通過激活COR6.6在擬南芥響應(yīng)低溫信號通路中具有調(diào)控作用。

ZFP179通過參與ABA依賴和ABA獨立的途徑，來增強植物本身抗非生物逆境脅迫能力，其中耐低溫能力增強效果最為顯著［49］。說明鋅指蛋白這一類轉(zhuǎn)錄因子對植物抗低溫脅迫也具有一定作用。

1.2 低溫脅迫下第二信使和激素分子的調(diào)控表達

Ca2+是重要的第二信使分子之一，當(dāng)植物受到外界低溫脅迫的刺激后，COLD1與G蛋白相互作用感知低溫并激活Ca2+通道，使細胞內(nèi)鈣離子濃度增加。鈣離子通過鈣調(diào)蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子CAMTA家族的成員與CM2序列結(jié)合，其中CAMTA3轉(zhuǎn)錄因子是CBF2表達的正調(diào)控因子［50-51］。

低溫脅迫條件下，乙烯在水稻低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中與AP2 / ERF家族成員相互作用，APETALA2/乙烯響應(yīng)因子（AP2 / ERF）是認為在水稻脅迫應(yīng)答途徑中起作用的轉(zhuǎn)錄因子。在乙烯信號傳導(dǎo)途徑中，乙烯通過與初級乙烯反應(yīng)元件（PERE）結(jié)合后，PERE再與EIN3和EIL1結(jié)合。EIN3和EIL1是介導(dǎo)乙烯信號的中心轉(zhuǎn)錄因子，能調(diào)節(jié)乙烯反應(yīng)蛋白的表達，其中包括轉(zhuǎn)錄因子乙烯反應(yīng)因子1（ERF1）［52］。

此外，EIN3可以結(jié)合CBF以ARR5/7/15的啟動子區(qū)域，乙烯負向調(diào)控低溫信號通過EIN3直接轉(zhuǎn)錄控制低溫調(diào)控CBF基因的表達［53］。有研究表明JAZ蛋白是茉莉酸信號傳導(dǎo)的抑制因子，與ICE1和ICE2轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生物理相互作用，其中JAZ1和JAZ4抑制ICE1的轉(zhuǎn)錄功能，從而減弱調(diào)節(jié)表達。茉莉酸還可以通過EIN3和EIL1負調(diào)節(jié)CBF/DREB1基因的表達［54-55］。

2 低溫響應(yīng)相關(guān)啟動子及其功能元件的分析與鑒定

核心啟動子含有多個順式作用元件，轉(zhuǎn)錄因子的作用是特異性結(jié)合目的基因核心啟動子上順式作用元件，調(diào)控下游基因表達［61-63］。在轉(zhuǎn)錄起始前通用轉(zhuǎn)錄因子TFIID、TFIIB與RNA聚合酶Ⅱ形成蛋白復(fù)合物，轉(zhuǎn)錄過程中，轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合作用元件，同時與轉(zhuǎn)錄復(fù)合體相互作用，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄水平［64］。表1中列舉一些受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的參與低溫脅迫的靶基因及其相關(guān)功能。

目前，常用的查找和鑒定啟動子的數(shù)據(jù)庫有Gene MANIA、Plant CARE、PLACE、Plant PAN、Soft Berry、Genomatix 和 Matinspector［65］。使用 Plant CARE和Gene MANIA網(wǎng)站可以預(yù)測和建立可能存在的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。植物體內(nèi)的順式作用元件數(shù)量較多，目前被確定參與植物低溫脅迫響應(yīng)的順式作用元件有ERF、ABRE、DRE、CRT、W-BOX和LTRE等［64］。擬南芥中CBF基因可以結(jié)合COR和DRE基因啟動子上的CRT/DRE的順式作用元件［66］。缺失分析LRK6（亮氨酸受體激酶）啟動子的差分序列DSLP2，酵母單雜交表明與其互作的ERF蛋白是OsERF3。通過序列分析和致突變試驗表明在DSLP2中發(fā)現(xiàn)了OsERF3的結(jié)合序列（TAA（A）GT）［67］。缺失分析ABA誘導(dǎo)啟動子，確定了ABA響應(yīng)元件（ACGT）并命名為 ABRE［68］。

表1 低溫下轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的靶基因及其可能的功能

3 響應(yīng)低溫脅迫的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

在的正常生長發(fā)育過程中，植物難免遭受多種外界脅迫傷害，其中以低溫傷害最為嚴(yán)重。在逆境脅迫條件下，為了保障自身的正常生長發(fā)育，它們進化出一個穩(wěn)定且靈活基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［4］。接收到脅迫信號刺激后，植物體內(nèi)的信號分子如激素、次級信使和酶等物質(zhì)激活各轉(zhuǎn)錄因子表達，激活的轉(zhuǎn)錄因子激活或者抑制下游低溫相關(guān)基因的表達，從而調(diào)節(jié)植物自身的低溫耐受能力。

已有研究表明植物低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑由各類轉(zhuǎn)錄因子家族成員共同參與、相互作用。鈣調(diào)蛋白是不僅是CBF轉(zhuǎn)錄因子的正向調(diào)節(jié)因子，同時也能結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子CAMTA3［50］。研究表明MYB15是CBF調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要調(diào)控因子，MYB15蛋白是CBF基因的負調(diào)節(jié)因子，它識別結(jié)合CBF3基因啟動子上的MYC元件，并且與ICE1基因相互作用抑制CBF3基因表達。相關(guān)研究表明，R2R3-MYB蛋白作為乙烯響應(yīng)因子誘導(dǎo)低溫脅迫早期植物體內(nèi)的低溫信號應(yīng)激反應(yīng)［69］，乙烯分子參與了植物的低溫信號通路。

在低溫脅迫條件下，ICE1基因的突變幾乎對CBF1和CBF2基因表達沒有影響，這說明了在植物的低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中除了CBF轉(zhuǎn)錄因子還有其他家族轉(zhuǎn)錄因子的參與。另有研究表明AtWRKY34是通過激活CBF調(diào)控因子的轉(zhuǎn)錄表達反向調(diào)節(jié)擬南芥成熟花粉的低溫敏感性［24］。除了CBF與MYB轉(zhuǎn)錄因子的相互作用，植物體內(nèi)的低溫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也有NAC、WRKY、bZIP等轉(zhuǎn)錄因子的參與。已被證明擬南芥AtNAC019參與了AtMYB88基因調(diào)控的低溫信號途徑［35］。

另有研究證明，在發(fā)現(xiàn)的101個BdNAC中至少有一個激素和低溫脅迫有關(guān)的順式作用元件，其中44個基因有超過5個以上的作用元件，說明BdNAC基因參與植物低溫脅迫與激素相互作用的過程［70-71］。同時，在BdNAC啟動子上檢測到135個ABA應(yīng)答元件（ABREs），107個茉莉酸應(yīng)答元件，99個MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，66個SA應(yīng)答元件，表明NAC基因在脫落酸、茉莉酸、水楊酸信號通路中扮演重要角色［18］。DREB1A、DREB1C和DEAR3蛋白可以結(jié)合目的基因啟動子上的ABRE、ERF作用元件來響應(yīng)低溫脅迫，表明DREB轉(zhuǎn)錄因子不僅參與植物低溫應(yīng)激反應(yīng)，并且參與脫落酸、乙烯等植物激素信號通路［65］。

在構(gòu)樹中發(fā)現(xiàn)82個AP2/ERF、39個NAC、71個 WRKY、45個 MYB、89個 bZIP、41個 ZFPs基因參與低溫脅迫響應(yīng)反應(yīng)［72］。在擬南芥成熟花粉中，有93個來自多個轉(zhuǎn)錄因子家族的基因如AP2/ERF、NAC、WRKY、MYB、bZIP參與植物低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［73］。在木薯頂端芽，鑒定出了32個在低溫早期反應(yīng)中產(chǎn)生作用的低溫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子。其中有6個AP2/ERF、5個MYB、和5個GRAS轉(zhuǎn)錄因子［74］。這些研究結(jié)果說明，植物體內(nèi)的低溫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)由AP2/ERF、NAC、WRKY、MYB、bZIP和ZFPs等多種轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控而實現(xiàn)其功能的。

同時，將參與低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的6類轉(zhuǎn)錄因子及其相關(guān)功能列舉出來，如表2所示。

在ABA依賴途徑中，bZIP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基因啟動子上的ABER元件，激活冷響應(yīng)基因表達；在ABA獨立信號途徑中，MYB與MYC轉(zhuǎn)錄因子相互作用識別MYB作用元件，激活冷響應(yīng)基因表達。其他CBF、NAC、WRKY幾類轉(zhuǎn)錄因子家族，通過識別下游冷響應(yīng)基因上的CRT/DRE、ERF、W-BOX、GCC-BOX等元件激活下游基因表達，從而引起轉(zhuǎn)基因植株的相關(guān)表型發(fā)生改變，如圖1所示。

表2 植物體內(nèi)參與冷脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子以及相關(guān)基因功能

圖1 低溫狀態(tài)下植物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子相互作用的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

4 展望

轉(zhuǎn)錄因子在植物低溫信號途徑中扮演十分重要的角色。NAC、WRKY、MYB、b ZIP、ZFPs等轉(zhuǎn)錄因子家族激活低溫相關(guān)基因的表達從而調(diào)控植物的低溫耐受能力。同時參與ABA（脫落酸）、JAs（茉莉酸）、SA（水楊酸）、乙烯等途徑進一步增強植物對低溫脅迫的調(diào)節(jié)能力。雖然在現(xiàn)代生物技術(shù)手段的幫助下，轉(zhuǎn)錄因子在低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的調(diào)控機理的研究取得了突破，但是由于低溫信號途徑中參與的調(diào)控因子數(shù)量過于巨大，其間相互關(guān)系也十分復(fù)雜，目前仍然存在著很多問題，如同一轉(zhuǎn)錄因子在不同信號通路中是否具有相同功能；各轉(zhuǎn)錄因子家族是否同時參與低溫應(yīng)激反應(yīng)等，這些問題仍然是人們未來研究工作的重點內(nèi)容。進一步了解轉(zhuǎn)錄因子對逆境脅迫調(diào)控的作用機理，為今后的育種選育與改良提供了非常堅實的理論依據(jù)和研究背景。