徐雅夢(mèng) 姜曉冰 于濤

（1. 河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453007；2. 新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003）

單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）是一種重要的食源性致病菌，該菌在自然界分布廣泛，易對(duì)熟肉制品、乳制品、海產(chǎn)品和蔬菜等食品造成污染。攝入被Lm污染的食品可引起李斯特菌?。↙isteriosis）的爆發(fā)和流行［1］。老人、孕婦、新生兒以及免疫力低下者是李斯特菌病的易感人群，臨床癥狀主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎、孕婦流產(chǎn)等［2］。李斯特菌病在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率較低，但是其致死率卻高達(dá)25.9%［3］，嚴(yán)重威脅人類的健康。為了防止食品被致病菌污染，食品企業(yè)通常使用消毒劑來(lái)抑制或殺滅食品加工環(huán)境中的微生物。苯扎氯銨（Benzalkonium chloride，BC）屬于季銨鹽類消毒劑，被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)領(lǐng)域。BC的長(zhǎng)期使用可能會(huì)促使耐藥菌株的出現(xiàn)，影響其消毒效果。

許多文獻(xiàn)報(bào)道，從食品加工環(huán)境和市售食品中分離的Lm菌株對(duì)BC敏感性下降［4-6］。目前研究者普遍認(rèn)為外排泵是介導(dǎo)Lm對(duì)BC耐受的主要機(jī)制。外排泵屬于膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在細(xì)菌中廣泛存在。除了參與細(xì)胞的正常物質(zhì)運(yùn)輸和代謝，外排泵還能夠去除細(xì)菌細(xì)胞和胞膜中的有害物質(zhì)，幫助細(xì)菌抵御外界不良環(huán)境的影響［7］。研究報(bào)道，一些外排泵可將抗生素、消毒劑、重金屬等作為底物排出菌體外使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性［8］。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)，主要易化子超家族（Major facilitator superfamily，MFS）外排泵MdrL在Lm對(duì)BC耐受中起作用。根據(jù)Lm全基因組序列可知，ladR基因反向位于mdrL外排泵基因的上游，編碼的LadR蛋白由176個(gè)氨基酸分子組成，屬于PadR轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控蛋白家族。Huillet等［9］推測(cè)，mdrL基因的啟動(dòng)子區(qū)域可能存在調(diào)控蛋白LadR的結(jié)合位點(diǎn)，但這一推測(cè)并沒(méi)有被進(jìn)一步證實(shí)。本研究以Lm標(biāo)準(zhǔn)菌株EGD-e為研究對(duì)象，利用同源重組技術(shù)［10］構(gòu)建ladR基因缺失菌株ΔladR，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction，qRT-PCR）、凝膠阻滯試驗(yàn)（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA）等調(diào)查L(zhǎng)adR蛋白對(duì)外排泵MdrL的調(diào)控作用及調(diào)控方式。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 Lm標(biāo)準(zhǔn)菌株EGD-e由華中師范大學(xué)羅勤教授惠贈(zèng)；穿梭質(zhì)粒pMAD和表達(dá)載體pET32a由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京博邁德基因技術(shù)有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑 腦心浸液培養(yǎng)基（Brain Heart Infusion，BHI），購(gòu)自北京陸橋生物技術(shù)有限公司；苯扎氯銨，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒，購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher；TaqDNA聚合酶和dNTP，購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5×），購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.1.3 儀器與設(shè)備 DH360型電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京科偉永興儀器有限公司；THZ-82氣浴恒溫振蕩器，金壇天竟實(shí)驗(yàn)儀器廠；TGL-16B型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；ETC811型基因擴(kuò)增儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；DYY-8C型電泳儀，北京市六一儀器廠；LightCycler@96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，瑞士Roche；UNIVERSAL HOOD II 凝膠成像分析系統(tǒng)、Gene PulserXcellTM電轉(zhuǎn)儀，美國(guó) Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1ladR基因缺失突變株的構(gòu)建與分子鑒定 以EGD-e基因組DNA為模板，分別用1408-1/1408-2和1408-3/1408-4兩對(duì)引物擴(kuò)增ladR基因的上下游同源臂，引物序列見(jiàn)表1。利用重疊延伸PCR（Splicing by Overlap Extension，SOE-PCR） 技 術(shù)［11］融 合 上下游同源臂，融合片段經(jīng)切膠回收后與穿梭載體pMAD分別用限制性內(nèi)切酶BamH I和MluI進(jìn)行同步雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行連接反應(yīng)，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pMAD-ΔladR轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株送至北京博邁德基因技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

采用青霉素G法制備EGD-e感受態(tài)細(xì)胞［12］。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pMAD-ΔladR與EGD-e感受態(tài)細(xì)胞混勻，電擊后立刻加入500 μL BHI培養(yǎng)基于30℃培養(yǎng)3 h。將菌液均勻涂布于含紅霉素（5 μg/mL）、和X-gal的BHI平板上，30℃培養(yǎng)48 h。挑取藍(lán)色單菌落于含紅霉素（5 μg/mL）的BHI液體培養(yǎng)基，39℃培養(yǎng)24 h。稀釋菌液選擇合適梯度的稀釋液涂布于含紅霉素（5 μg/mL）和X-gal的BHI平板上，39℃培養(yǎng)48 h。挑取藍(lán)色單菌落于BHI液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h。將菌液轉(zhuǎn)接至新鮮的BHI，39℃培養(yǎng)。稀釋菌液選擇合適梯度的稀釋液涂布于含X-gal的BHI平板上，39℃培養(yǎng)48 h。挑取白色單菌落用引物1408-1和1408-4進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)缺失條帶，最終獲得ΔladR突變株。

表1 PCR擴(kuò)增所用引物

1.2.2mdrL基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè) 將野生株EGD-e和突變株ΔladR分別接種至BHI中（各6管），37℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm≈0.6。將菌株平均分為兩組，第一組為不加任何藥物（作為對(duì)照組），第二組為加入BC（2 μg/mL），37℃繼續(xù)培養(yǎng)30 min。立即加入10%的反應(yīng)終止液（苯酚∶無(wú)水乙醇=1∶9）［13］，冰上放置10 min。

按照細(xì)菌RNA提取試劑盒的使用說(shuō)明提取細(xì)菌總RNA，測(cè)定RNA的濃度和純度后用于后續(xù)試驗(yàn)。利用cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank的基因序列設(shè)計(jì)靶基因mdrL和參照基因16S rRNA的引物（表2）。以cDNA作為模板，使用RealMasterMix（SYBR Green）試劑盒進(jìn)行 qRT-PCR。采用 ΔΔCT法［14］進(jìn)行目的基因表達(dá)量的分析。

1.2.3ladR基因的克隆 以EGD-e的基因組DNA作為擴(kuò)增模板，用引物ladR-q1和ladR-q2（表1）擴(kuò)增ladR全基因序列。ladR擴(kuò)增產(chǎn)物與表達(dá)載體pET32a分別用限制性內(nèi)切酶BamH I和XhoI進(jìn)行同步雙酶切，酶切后的產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行連接反應(yīng)，將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體pET32a-ladR轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3），挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株送至北京博邁德公司測(cè)序。

1.2.4 LadR蛋白的表達(dá)與純化 將LadR蛋白表達(dá)菌株接種于5 mL含Amp（100 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。過(guò)夜培養(yǎng)物按1∶100分別接種至50 mL含Amp（100 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm≈0.6。將菌液分兩組，一組不做任何處理，另一組加入終濃度為0.5 mmol/L［15］的 IPTG，37℃ 繼 續(xù) 培 養(yǎng) 8 h。 離 心（4 000×g，5 min）收集細(xì)胞。按照His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒的步驟提取純化重組蛋白His6-LadR。取10 μL純化蛋白進(jìn)行SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）［16］。利用 BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定重組蛋白His6-LadR的濃度。

1.2.5 凝膠阻滯試驗(yàn) 利用引物pmdrL-F/pmdrL-R擴(kuò)增mdrL的啟動(dòng)子區(qū)域，同時(shí)隨機(jī)挑選一段編碼區(qū)DNA（recA）作為陰性對(duì)照。將純化后的DNA（200 ng）與純化后的重組蛋白His6-LadR在EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液中混合，室溫放置20 min。利用6%非變性PAGE電泳進(jìn)行結(jié)合活性檢測(cè)［17］。

2 結(jié)果

2.1 ladR基因缺失菌株的構(gòu)建與分子鑒定

用引物1408-1/1408-2擴(kuò)增得到ladR基因上游同源臂480 bp，用引物1408-3/1408-4擴(kuò)增ladR下游同源臂168 bp。通過(guò)SOE-PCR得到648 bp的上、下游同源臂融合片段ΔladR，條帶均與預(yù)期結(jié)果一致（圖1-A）。融合片段ΔladR與穿梭質(zhì)粒pMAD連接獲得重組質(zhì)粒pMAD-ΔladR。雙酶切驗(yàn)證結(jié)果如圖1-B。

測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pMAD-ΔladR電轉(zhuǎn)至EGD-e感受態(tài)。篩選得到的陽(yáng)性菌株用檢測(cè)引物1408-1/1408-4只能擴(kuò)增出648 bp的片段（圖1-C）。測(cè)序結(jié)果表明已成功缺失ladR基因，獲得ΔladR突變株。

圖1 ladR基因缺失株的構(gòu)建

2.2 mdrL基因轉(zhuǎn)錄水平分析

由圖2可明顯看出，與野生株相比，突變株ΔladR的mdrL基因的轉(zhuǎn)錄水平提高約51倍。BC脅迫下，野生株EGD-e的mdrL基因轉(zhuǎn)錄水平提高約1.6倍，突變株ΔladR的mdrL基因的轉(zhuǎn)錄水平約1.4倍。該結(jié)果表明LadR對(duì)mdrL基因有負(fù)調(diào)控作用。

圖2 qRT-PCR檢測(cè)mdrL基因轉(zhuǎn)錄水平

2.3 ladR基因的克隆

以EGD-e基因組DNA為模板擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為525 bp的ladR全基因片段（圖3）；構(gòu)建得到的重組質(zhì)粒pET32a-ladR經(jīng)雙酶切驗(yàn)證及測(cè)序，驗(yàn)證結(jié)果一致表明已成功獲得表達(dá)菌BL21（DE3）-ladR。

圖3 表達(dá)菌BL21（DE3）-ladR的構(gòu)建

2.4 LadR蛋白的表達(dá)及純化

IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)宿主菌在35 kD附近出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶，與預(yù)期的蛋白分子量大?。?6.5 kD）十分相近（圖4），表明目的蛋白在宿主菌已得到成功表達(dá)。利用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒處理后可以得到高純度的His6-LadR蛋白；經(jīng)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定可知其濃度為1 mg/mL。

M：蛋白maker；1：純化蛋白；2：陰性對(duì)照；3～5：IPTG誘導(dǎo)

2.5 凝膠阻滯試驗(yàn)

EMSA結(jié)果（圖5-A）顯示，LadR蛋白可與mdrL基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，并且該結(jié)合作用在一定范圍內(nèi)隨LadR蛋白濃度升高而增強(qiáng)；而在所有蛋白濃度下，陰性對(duì)照recA基因均未出現(xiàn)阻滯條帶（圖5-B）。結(jié)果表明，LadR蛋白可與mdrL啟動(dòng)子序列發(fā)生特異性結(jié)合作用。

圖5 重組蛋白His6-LadR與啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合活性

3 討論

Tamburro等［18］研究報(bào)道，BC脅迫下mdrL基因出現(xiàn)明顯過(guò)表達(dá)現(xiàn)象，推測(cè)MdrL外排泵在Lm對(duì)BC耐受中起作用。Romanov等［19-20］通過(guò)檢測(cè)不同Lm菌株中mdrL基因的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，BC脅迫下mdrL基因的轉(zhuǎn)錄水平升高4-20倍，該結(jié)果表明在BC刺激下不同菌株的mdrL基因表達(dá)量呈現(xiàn)差異性。我們先前的研究結(jié)果顯示，與野生株EGD-e相比，mdrL基因缺失突變株ΔmdrL在亞致死濃度BC脅迫下的生長(zhǎng)遲滯期延長(zhǎng)、平均最大生長(zhǎng)率和平均最大光密度值均降低；在致死濃度BC作用下的存活率降低2個(gè)log值，表明MdrL外排泵在Lm對(duì)BC耐受中起作用。本研究結(jié)果顯示，BC作用下，mdrL基因在野生株EGD-e中的轉(zhuǎn)錄水平提高約1.6倍，表明BC能夠誘導(dǎo)mdrL基因的表達(dá)。不過(guò)，與前人的研究結(jié)果相比，本研究中mdrL基因轉(zhuǎn)錄水平升高的倍數(shù)較低。其原因可能有三點(diǎn)：一是菌株自身的差異性；二是BC刺激的時(shí)期不同；三是BC作用的濃度不同。

Huillet等［9］利用 Northern blot技術(shù)檢測(cè)mdrL基因的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LadR蛋白對(duì)mdrL基因具有負(fù)調(diào)控作用，并推測(cè)在正常生長(zhǎng)條件下（BHI培養(yǎng)基），LadR與mdrL基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，從而抑制mdrL外排泵基因的轉(zhuǎn)錄。本論文在前人研究的基礎(chǔ)上，深入調(diào)查L(zhǎng)adR蛋白對(duì)MdrL外排泵的調(diào)控機(jī)制。qRT-PCR結(jié)果顯示，無(wú)BC刺激時(shí)，mdrL基因在ladR基因缺失突變株中的轉(zhuǎn)錄水平比野生株EGD-e高51倍，表明LadR蛋白可能負(fù)調(diào)控mdrL基因的轉(zhuǎn)錄；BC作用下，mdrL基因在突變株中的轉(zhuǎn)錄水平比EGD-e高1.4倍，我們推測(cè)在BC脅迫下，除了LadR蛋白可能還存在其他的調(diào)控蛋白參與mdrL的調(diào)控。EMSA試驗(yàn)［21］結(jié)果顯示，LadR蛋白能夠與mdrL基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，并且其結(jié)合活性隨蛋白濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)?shù)鞍诐舛却笥?.4 mg/mL時(shí)，結(jié)合活性沒(méi)有明顯變化。LadR蛋白與recA基因的編碼區(qū)沒(méi)有發(fā)生結(jié)合作用，表明LadR與mdrL基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合具有特異性。

4 結(jié)論

本研究以Lm標(biāo)準(zhǔn)菌株EGD-e為研究對(duì)象，深入調(diào)查L(zhǎng)adR對(duì)MdrL外排泵的調(diào)控作用及其調(diào)控方式。結(jié)果表明，BC能夠誘導(dǎo)mdrL基因的表達(dá)。LadR蛋白負(fù)調(diào)控mdrL基因的表達(dá)；在正常生長(zhǎng)條件下，LadR與mdrL基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，抑制外排泵基因mdrL的表達(dá)。