， ， ，

(1.中國(guó)貴州茅臺(tái)酒廠(集團(tuán))有限責(zé)任公司，貴州仁懷 564501；2.貴州茅臺(tái)酒股份有限公司，貴州仁懷 564501)

揮發(fā)性酚類化合物是飲料酒中的重要風(fēng)味物質(zhì)，其對(duì)于酒的聞香、口感以及穩(wěn)定性等方面具有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)香草醛、4-乙基苯酚、愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-丙基愈創(chuàng)木酚在朗姆酒中的香氣強(qiáng)度(OAV)≥1[1]；愈創(chuàng)木酚和香草醛是威士忌關(guān)鍵香氣的組成成分[2 - 3]；葡萄酒中4-乙基苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚兩種酚類總濃度小于400μg/L時(shí)貢獻(xiàn)辛香、煙熏香等，大于620μg/L時(shí)會(huì)給酒樣帶來(lái)“酚味”、“動(dòng)物臭”、“馬廄臭”等風(fēng)味缺陷[4 - 5]。近年來(lái)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)受林火煙霧污染的葡萄會(huì)給酒體帶來(lái)高濃度酚類物質(zhì)，從而出現(xiàn)煙熏味、灰燼味以及燒焦味等缺陷風(fēng)味[6]。酚類物質(zhì)對(duì)中國(guó)白酒的風(fēng)味影響同樣倍受關(guān)注，近幾年的研究認(rèn)為4-甲基苯酚主要與濃香型白酒窖泥及白酒中異嗅有關(guān)，但相關(guān)研究還較少[7 - 8]。因此，快速、準(zhǔn)確定性定量分析酒精類飲料中揮發(fā)性酚類化合物對(duì)風(fēng)味研究具有重要意義。

目前，已報(bào)道的酒精類飲料中揮發(fā)性酚類化合物測(cè)定方法，主要是各種預(yù)處理方法與氣相色譜或液相色譜聯(lián)用，如浸入式固相微萃取(DI-SPME)[9]、攪拌棒吸附萃取(SBSE)[10]、液-液萃取(LLE)[11]、C18固相萃取[12]，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法；LLE結(jié)合高效液相色譜(HPLC)分離，采用熒光檢測(cè)器(FLD)或二極管陣列檢測(cè)器(DAD)測(cè)定[13 - 14]。DI-SPME、SBSE方法操作簡(jiǎn)便，但存在競(jìng)爭(zhēng)吸附，影響低含量酚類物質(zhì)檢測(cè)的靈敏度，HPLC主要適用于難揮發(fā)性酚類化合物分析，LLE及C18固相萃取的方法需要氮吹濃縮、洗脫等步驟，有機(jī)溶劑用量較大。液-液微萃取(LLME)作為一種預(yù)處理方式，具有萃取效率高、操作方便、儀器條件要求低、有機(jī)溶劑用量少等優(yōu)點(diǎn)，但目前在酚類化合物分析方面的應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用直接LLME，對(duì)萃取溶劑種類、用量、萃取酒精度、萃取pH等條件進(jìn)行優(yōu)化選擇，最終有機(jī)相可直接進(jìn)樣分析，無(wú)需氮吹濃縮步驟，建立了一種準(zhǔn)確、快速定性定量分析飲料酒中揮發(fā)性酚類化合物的方法。本方法對(duì)于酒精度大于10%vol的酒樣先進(jìn)行稀釋降度，對(duì)于酒精度小于10%vol的飲料酒無(wú)需進(jìn)行稀釋。并使用該方法分析了市場(chǎng)上不同白酒及威士忌樣品中的揮發(fā)性酚類化合物，結(jié)果表明，所測(cè)得9種揮發(fā)揮發(fā)性酚類化合物在不同類型酒精飲料中含量分布差異較大。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

AgilentGC7890A-5975MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；VORTEX-GENIE2渦旋振蕩器；梅特勒公司MS1602TS分析天平；艾科普AFX-2002-U超純水純化系統(tǒng)。

標(biāo)準(zhǔn)品：苯酚(Phenol)、4-甲基苯酚(4-Methylphenol)、4-乙基苯酚(4-Ethylphenol)、愈創(chuàng)木酚(Guaiacol)、4-甲基愈創(chuàng)木酚(4-Methylguaiacol)、4-乙基愈創(chuàng)木酚(4-Ethylguaiacol)、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚(4-Vinylguaiacol)、香草醛(Vanillin)、香草酸乙酯(Vanilicacidethylester)、3,4-二甲基苯酚(3,4-Dimethylphenol，內(nèi)標(biāo))，純度均大于99%，均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液配制：分別準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，用乙醇配成濃度約為10000mg/L標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液，置于4℃冰箱中保存待用。乙醚(分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；戊烷(色譜純，美國(guó)天地公司)，重蒸后使用；NaCl(分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙醇(色譜純，純度99.9%，ACS公司)。水為超純水。

酒樣：市售醬香型白酒、濃香型白酒、清香型白酒、威士忌。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品預(yù)處理準(zhǔn)確吸取5 mL酒樣于40 mL樣品瓶中，加超純水稀釋酒精度至10% vol，再加入8.5 g NaCl進(jìn)行飽和，加入2 μL 3,4-二甲基苯酚溶液作為內(nèi)標(biāo)，然后加入萃取劑，渦旋振蕩1 min，靜置分層，吸取上層有機(jī)相進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析。

1.2.2儀器條件氣相色譜條件：DB-FFAP毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度為230 ℃，載氣為氦氣，流速1.3 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL，不分流進(jìn)樣；升溫程序：40 ℃，不保持；1 ℃/min升至50 ℃；5 ℃/min升至220 ℃，保持10 min。質(zhì)譜條件：離子源(EI)，電子轟擊能量為70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，采集模式為全掃描模式(SCAN)及選擇離子監(jiān)測(cè)模式(SIM)，SCAN用于定性，SIM用于定量。定量離子的選擇兼顧每種化合物碎片離子的特異性及豐度，排除干擾的同時(shí)提高靈敏度，詳細(xì)參數(shù)見(jiàn)表1，檢索譜庫(kù)為NIST 14a.L。

表1 選擇離子監(jiān)測(cè)模式條件

1.2.3定性與定量分析采用SIM的方法對(duì)9種酚類化合物進(jìn)行積分，以標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為橫坐標(biāo)(x)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度與內(nèi)標(biāo)濃度之比為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3,4-二甲基苯酚為內(nèi)標(biāo)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。以53%乙醇-水溶液為基質(zhì)，將9種待測(cè)酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品配制成混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，采用兩倍稀釋法得到一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將待測(cè)樣品按照1.2.1方法進(jìn)行預(yù)處理后，吸取上層有機(jī)相進(jìn)樣分析，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中待測(cè)物濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 液-液微萃取方法的建立

圖1 萃取溶劑的選擇Fig.1 Selection of extraction solvent

2.1.1萃取溶劑的選擇由于待測(cè)酚類化合物種類較多，選擇的萃取溶劑需兼顧多種酚類的萃取效果。乙醚與戊烷是白酒分析常用、且效果較好的極性與非極性萃取溶劑，實(shí)驗(yàn)比較了乙醚、戊烷、乙醚-戊烷(體積比1∶1)分別為萃取溶劑時(shí)酚類化合物的萃取效果(圖1)，以能夠檢測(cè)到的酚類化合物種類及總峰面積為考量指標(biāo)。結(jié)果表明，采用乙醚為萃取溶劑時(shí)，酚類化合物萃取效果最佳，乙醚與酚類化合物同屬極性化合物，戊烷為非極性溶劑，根據(jù)相似相溶原理，乙醚萃取效果優(yōu)于戊烷，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相符，選擇乙醚作為萃取溶劑。

2.1.2萃取溶劑用量及萃取級(jí)數(shù)的選擇酚類化合物在白酒中為微量成分，因此酒樣用量不宜過(guò)少，同時(shí)考慮方法的操作便捷性，選擇酒樣用量為5 mL，在滿足萃取效率及操作便捷性的同時(shí)，減少萃取劑用量可省去氮吹濃縮步驟，且環(huán)保性好。當(dāng)有機(jī)溶劑為1 mL時(shí)，吸取上層有機(jī)相較困難，因此選擇萃取溶劑用量為2 mL。為保證萃取效率，實(shí)驗(yàn)考察了多級(jí)萃取的效果，以乙醚為萃取劑，每次加入2 mL，共萃取3次。結(jié)果顯示：除愈創(chuàng)木酚及香草醛一次萃取效率略低于90%，其余7種酚類物質(zhì)一次萃取效率均在90%以上，總酚類的萃取效率也在90%以上(圖2)，第三級(jí)萃取峰面積相對(duì)前兩次可忽略不計(jì)(<3%)。因此方法選擇2 mL萃取溶劑萃取一次。

2.1.3萃取酒精度的選擇由于酒精度影響萃取效果，實(shí)驗(yàn)采用加水稀釋的方法降低樣品的酒精度，分別比較了在5% vol、10% vol、15% vol、20% vol 4種酒精度條件下能夠檢測(cè)到的酚類化合物種類數(shù)及總峰面積(圖3)。結(jié)果顯示，低的酒精度利于酚類物質(zhì)的萃取，酒精度過(guò)高時(shí)，目標(biāo)物萃取分離效果差，隨著酒精度的降低，酚類物質(zhì)響應(yīng)及種類呈上升趨勢(shì)，當(dāng)酒精度為10% vol與5% vol時(shí)，能夠檢測(cè)到的酚類化合物種類相同，酚類總峰面積也基本相同，兼顧操作的便捷性及分析成本，實(shí)驗(yàn)選擇萃取酒精度為10% vol。根據(jù)這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們也可以知道對(duì)于酒精度低于10% vol的飲料酒，可直接進(jìn)行萃取，無(wú)需稀釋步驟。

圖2 萃取級(jí)數(shù)的選擇Fig.2 Selection of extraction frequency

圖3 酒精度的選擇Fig.3 Selection of alcohol concentration

圖4 萃取pH的選擇Fig.4 Selection of pH

2.1.4萃取pH條件的選擇酚類物質(zhì)帶有酚羥基，一般呈弱酸性，但白酒中同時(shí)含有豐富的有機(jī)酸，與酚類物質(zhì)性質(zhì)相近，且酚類物質(zhì)與高級(jí)脂肪酸酯出峰時(shí)間相近，這些都會(huì)對(duì)酚類物質(zhì)分析造成干擾，因此實(shí)驗(yàn)通過(guò)調(diào)整不同的pH以期減少有機(jī)酸的干擾，提高酚類物質(zhì)萃取效率。實(shí)驗(yàn)采用10%NaHCO3溶液及0.1 mol/L H2SO4對(duì)加水稀釋后的酒樣pH進(jìn)行調(diào)節(jié)。實(shí)驗(yàn)分別比較了pH為1、3、5及7時(shí)酚類的萃取效果(圖4)，其中pH=3為不進(jìn)行調(diào)節(jié)時(shí)酒樣的原始pH。結(jié)果表明，pH=3時(shí)，9種酚類的萃取效果均最佳。當(dāng)pH為5、7時(shí)，雖然可適當(dāng)減小有機(jī)酸的影響，但酚羥基可能也被部分中和，因此選擇萃取pH條件為3，即不進(jìn)行pH調(diào)節(jié)。

圖5 9種酚類化合物的總離子流(TIC)色譜圖Fig.5 TIC chromatogram of 9 phenol compounds1.Guaiacol;2.4-Methylguaiacol;3.Phenol;4.4-ethylguaiacol;5.4-Methylphenol;6.4-Ethylphenol;7.4-Vinylguaiacol;8.3,4-Dimethylphenol;9.Vanillin;10.Vanilicacidethylester.

綜上，優(yōu)化條件下，9種酚類物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的SIM總離子流色譜圖如圖5，可以看出9種酚類物質(zhì)均具有較好的峰形，且能達(dá)到良好的分離效果。

2.2 方法評(píng)價(jià)

2.2.1線性范圍、檢出限與定量限按照1.2.3方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，9種揮發(fā)性酚類化合物在一定濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R2≥0.997)。按3倍和10倍信噪比計(jì)算得到9種酚類化合物的檢出限(S/N≥3)及定量限(S/N≥10)，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)待測(cè)樣品中待測(cè)組分進(jìn)行內(nèi)標(biāo)法定量，樣品的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性范圍內(nèi)，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.2回收率與精密度本方法采用加入回收試驗(yàn)進(jìn)行準(zhǔn)確度和精密度的評(píng)價(jià)。以酚類化合物含量較低的酒樣為基質(zhì)，分別按照高、中、低3個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定，每個(gè)水平做6個(gè)平行，各化合物回收率及精密度見(jiàn)表3。結(jié)果表明：9種酚類化合物不同濃度的添加回收率為88.3%～108.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.6%～6.4%。本方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)的要求。

表2 9種酚類化合物的線性范圍、線性關(guān)系、檢出限(LODs)及定量限(LOQs)

表3 9種酚類化合物的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)(n=6)

(續(xù)表3)

CompoundSpiked(μg/L)Background(μg/L)Recovery(%)RSD(%)196.891.35.6106.0103.16.4Vanilicacidethylester28.111.288.10.718.789.92.29.35103.90.8

2.3 實(shí)際樣品的測(cè)定

應(yīng)用本方法對(duì)市售不同香型白酒樣品以及威士忌樣品進(jìn)行分析，其中醬香型白酒樣品(Maotai-flavor liquor)30個(gè)、濃香型白酒樣品(Luzhou-flavor liquor)28個(gè)、清香型白酒樣品(Fen-flavor liquor)6個(gè)、威士忌樣品(Whiskey)5個(gè)，共計(jì)69個(gè)樣品，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 市售樣品中揮發(fā)性酚類化合物

從表4可知，不同飲料酒中酚類化合物種類、含量間存在顯著差異，9種揮發(fā)性酚類物質(zhì)在清香型白酒及威士忌中均有檢出，但含量存在差異。苯酚、4-甲基苯酚存在于所有醬香型、濃香型、清香型及威士忌樣品中，從含量上講，這兩種酚類為酒精飲料中最主要的兩種酚類化合物。苯酚、4-甲基苯酚及4-乙基苯酚在濃香型白酒中含量明顯高于清香型及醬香型白酒，尤其4-甲基苯酚，可能與濃香型白酒所用窖泥及其工藝特點(diǎn)有關(guān)。醬香型白酒中愈創(chuàng)木酚含量與威士忌基本持平，含量范圍0～399.0 μg/L，高于濃香型白酒(0～41.7 μg/L)與清香型白酒(30.6～60.1 μg/L)，而張燦[8]采用的檢測(cè)方法在醬香型白酒中均未檢出愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，說(shuō)明本文方法靈敏度更高。威士忌中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、香草醛及香草酸乙酯含量范圍分別為129.0～212.9 μg/L，1154.2～2180.3 μg/L和131.1～279.2 μg/L，含量明顯高于其它幾種酒類，這與其儲(chǔ)存容器橡木桶有關(guān)[15]。

3 結(jié)論

本研究采用液-液微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了一種快速、準(zhǔn)確定性定量分析白酒中酚類物質(zhì)的方法。采用該方法檢測(cè)了64種市售不同香型中國(guó)白酒以及5種威士忌樣品，結(jié)果表明，該方法在白酒及威士忌樣品中均適用，所測(cè)9種酚類物質(zhì)在不同類型酒精飲料中含量分布差異較大。濃香型白酒中苯酚、4-甲基苯酚及4-乙基苯酚含量較高，威士忌中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、香草醛及香草酸乙酯含量明顯高于其它幾種酒類。本方法可為酒精類飲料中酚類物質(zhì)的研究提供方法參考。