楊 文，楊 艷，吳曉燕，王 芳，孫 倩，高 原，張歡歡，馮 文*，馬 寧

(1. 江蘇省連云港第一人民醫(yī)院，江蘇 連云港 222000; 2.海南省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，?？?570206)

胚胎著床是胎生哺乳動(dòng)物生殖過(guò)程中決定妊娠是否成功的關(guān)鍵所在。胚胎著床主要包括定位、黏著、侵入3個(gè)步驟，囊胚在一定位置靠近內(nèi)膜，并被安置在子宮角腔中某個(gè)適當(dāng)?shù)奈恢?，接著囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞黏著能力增強(qiáng)，使囊胚進(jìn)一步貼緊子宮內(nèi)膜，最后囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞通過(guò)分泌某種物質(zhì)使之侵入內(nèi)膜基質(zhì)。該過(guò)程是由細(xì)胞因子、黏著分子、性激素等多種分子通路所介導(dǎo)[1-2]。臨床上，低分子肝素鈣(low molecular weight heparin calcium, LMWHC)常用于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)以及反復(fù)著床失敗患者的治療，并認(rèn)為與LMWHC抗血栓抗凝作用有關(guān)[3-4]。本研究通過(guò)構(gòu)建妊娠小鼠模型，探討LMWHC對(duì)小鼠胚胎著床的影響，并從細(xì)胞分子水平上分析LMWHC的可能作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24只8～10周齡成熟未育的清潔級(jí)雌性昆明小鼠購(gòu)于蘇州新藥研究中心有限公司[SCXK(蘇)2013-0003]，體重30-35 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于蘇州市立醫(yī)院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室[SYXK(蘇)2017-0043]，室溫環(huán)境恒定溫度為25℃，每12 h 黑暗光照條件循環(huán)交替，動(dòng)物攝食和飲水自由，福利倫理審查證號(hào)201711A。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程中遵循3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM/F12 液體培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司(美國(guó))；胎牛血清、青鏈霉素混合液購(gòu)自于Life Technologies公司(美國(guó))；胰蛋白酶購(gòu)自于Sigma公司(美國(guó))；鼠抗人細(xì)胞角蛋白(cytokeratin,CK7)、波形蛋白(Vimentin,V9)單克隆抗體以及免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自于北京中杉生物試劑公司；基質(zhì)金屬蛋白酶-2 (matrix metalloproteinases-2, MMP-2)和金屬蛋白酶抑制因子-2(Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-2，TIMP-2)ELISA試劑盒購(gòu)自于ADL公司(美國(guó))；Transwell小室購(gòu)自于Corning公司(美國(guó))；Matrigel購(gòu)自于BD公司(美國(guó))；二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自于FORMA公司(美國(guó))；OLYMPUS BX50 生物顯微鏡購(gòu)自于OLYMPUS 公司(日本)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型的建立與材料收集

按2∶1的比例與成年雄性小鼠合籠交配，次日對(duì)雌性小鼠陰道進(jìn)行檢查，將檢出陰栓的小鼠視作妊娠D1。將妊娠小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和LMWHC組，每組各12只，LMWHC組小鼠按1000 U/kg腹腔注射LMWHC，對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水。妊娠D6時(shí)(6只孕鼠)，尾靜脈注射1%臺(tái)盼藍(lán) 100 μL，5 min 后處死孕鼠(頸椎脫臼法)，取出子宮，觀察子宮形態(tài)，記錄小鼠子宮藍(lán)色著床位點(diǎn)數(shù)。妊娠D9時(shí)(6只孕鼠)，著床點(diǎn)肉眼可見(jiàn)，直接處死，記錄小鼠子宮著床位點(diǎn)數(shù)。統(tǒng)計(jì)著床位點(diǎn)數(shù)，計(jì)算每組小鼠著床位點(diǎn)平均數(shù)。

1.3.2 滋養(yǎng)層細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定

另外選取妊娠D14的小鼠，頸椎脫臼法處死后分離胎盤(pán)組織，無(wú)菌鹽水清洗后將其剪碎，采用Zhou WH改良法[5]分離純化滋養(yǎng)層細(xì)胞。將滋養(yǎng)層細(xì)胞懸液濃度調(diào)整至每孔3×108個(gè)接種于放置有載玻片的6孔板內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清和雙抗(鏈霉素、青霉素)的DMEM/F12。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)，取出載玻片，PBS清洗3次后固定10 min，再次清洗3次，然后用3% H2O2去離子水孵育10 min，清洗后室溫封閉30 min。加入一抗(CK-7抗體、V9抗體以及PBS代替一抗作為陰性對(duì)照)低溫孵育過(guò)夜，PBS清洗3次后，加入二抗，室溫孵育60 min，PBS清洗3次后，經(jīng)顯色、復(fù)染、脫水、透明等步驟后封片，并觀察拍照，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率和陰性細(xì)胞率。

1.3.3 Transwell實(shí)驗(yàn)

預(yù)先將Matrigel包被在Transwell板濾膜表面，上室中加入濃度為每孔2×105個(gè)的滋養(yǎng)層細(xì)胞，分別采用1×102IU/L、1×103IU/L和1×104IU/L 濃度的LMWHC干預(yù)，不加LMWHC的細(xì)胞作為對(duì)照，下室中加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基800 μL，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置24 h，然后取出，將上室濾膜內(nèi)表面的細(xì)胞擦拭干凈，將濾膜下表面的細(xì)胞固定，經(jīng)瑞士染色后，在高倍鏡(×200)下觀察，每孔隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，每次不同LMWHC干預(yù)濃度以及對(duì)照設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 上清液中MMP-2和TIMP-2濃度檢測(cè)

將濃度為每孔3×108個(gè)的滋養(yǎng)層細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)箱內(nèi)靜置30 min后，分別采用1×102IU/L、1×103IU/L和1×104IU/L 濃度的LMWHC干預(yù)，不加LMWHC的細(xì)胞作為對(duì)照，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置24 h后收集上清，采用ELISA法檢測(cè)上清中MMP-2和TIMP-2水平。

注：A:子宮形態(tài)圖；B:胚胎著床點(diǎn)數(shù)統(tǒng)計(jì)。與對(duì)照組比較，*P<0.05。圖1 小鼠胚胎著床點(diǎn)數(shù)Note. A:Uterine morphogram; B:Embryo implantation count. Compared with the control group, *P<0.05.Figure 1 Number of mouse embryo implantation sites

1.3.5 Western blot實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞蛋白提取后按配方配制SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，待溴酚藍(lán)接近電泳槽底部時(shí)停止電泳，在電壓15 V，時(shí)間1.5 h，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，孵育一抗、孵育二抗，0.1% TBST漂洗PVDF膜，按1∶1等比例去ECL發(fā)光液A液和B液混合，在Alpha FluorChem Q 凝膠成像系統(tǒng)下曝光并成像，保留圖片后用于統(tǒng)計(jì)分析。蛋白條帶灰度值半定量分析：用Image J軟件對(duì)拍照下的蛋白條帶進(jìn)行灰度值測(cè)定。以目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值來(lái)校正上樣量的偏差，用二者灰度比值的高低表示各樣本目的蛋白表達(dá)量的多少。

1.3.6 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)實(shí)驗(yàn)

采用Trizol法并利用TIANGEN? RNA simple Total RNA Kit總RNA提取試劑盒，提取總RNA，按照StarScript II First-strand cDNA Synthesis Mix 試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用GenStar 2×Taq PCR Mix with Loading Dye 試劑盒加入引物進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束用2.1% 凝膠電泳。MMP-2引物序列，F(xiàn)orward primer：5’-CGCTCAGATCCGTGGTGAGAT-3’；Reverse primer：5’-CGGGAGCTCAGGCCAG AATG-3’，擴(kuò)增片段310 bp；TIMP-2引物序列，F(xiàn)orward primer：5’-CTCGCTGGACGTTGGAGGAAAG AA-3’，Reverse primer：5’-AGCCCATCTGGTACC TGTGTTCA-3’，擴(kuò)增片段150 bp；內(nèi)參β-actin引物序列：Forward primer：5’-ATATCGCTGCCGCTGGTC GTC-3’；Reverse primer：5’-AGGATGGCGTGAG GGAGACC-3’，擴(kuò)增片段517 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃ 2 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，72℃ 5 min，4℃ 延伸，共計(jì)35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后用2.1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 LMWHC對(duì)小鼠胚胎著床的影響

取妊娠D6和D9的小鼠子宮，記錄各小鼠胚胎著床位點(diǎn)數(shù)，結(jié)果顯示，LMWHC組妊娠D6和D9的著床位點(diǎn)數(shù)均多于對(duì)照組，差異有顯著性(P<0.05)，見(jiàn)表1和圖1。

表1 兩組胚胎著床位點(diǎn)數(shù)比較Table 1 Comparison of embryo implantation sites in two groups

2.2 小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞鑒定

經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)DAB實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞為CK7陽(yáng)性，細(xì)胞CK7陽(yáng)性率為(94.83±3.15)%，大多數(shù)細(xì)胞為V9陰性，細(xì)胞V9陰性率為(91.18±2.87)%，見(jiàn)圖2。

2.3 LMWHC對(duì)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲力的影響

用1×102IU/L、1×103IU/L和1×104IU/L 濃度的LMWHC干預(yù)滋養(yǎng)層細(xì)胞24 h后，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(84.83±14.15)個(gè)、(162.48±25.49)個(gè)、(98.73±12.77)個(gè)，與未用LMWHC干預(yù)細(xì)胞的(65.27±13.92)個(gè)比較，差異有顯著性(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖2 小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果(×200)Figure 2 Morphology of the mouse trophoblast cells.Immunohgistochemical staining.

注：A：不同濃度LMWHC干預(yù)滋養(yǎng)層細(xì)胞24 h后Transwell實(shí)驗(yàn)(×200)。B：不同濃度LMWHC干預(yù)滋養(yǎng)層細(xì)胞24 h后侵襲細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)。與對(duì)照組比較，*P<0.05。圖3 LMWHC對(duì)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲力的影響Note. A: Transwell assay after 24 h of different concentrations of LMWHC on trophoblast cells(×200). B: Statistics of invading cells in trophoblast cells after 24 h of different concentrations of LMWHC. Compared with the control group, *P<0.05.Figure 3 Effects of LMWHC on the invasiveness of mouse trophoblast cells

2.4 LMWHC對(duì)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞中細(xì)胞因子的影響

用1×102IU/L、1×103IU/L和1×104IU/L 濃度的LMWHC干預(yù)滋養(yǎng)層細(xì)胞24 h后，滋養(yǎng)層細(xì)胞上清液中MMP-2表達(dá)水平較未用LMWHC干預(yù)的細(xì)胞均升高，差異有顯著性(P<0.05)，當(dāng)LMWHC干預(yù)濃度為1×103IU/L時(shí)，MMP-2表達(dá)水平最高。滋養(yǎng)層細(xì)胞上清液中TIMP-2表達(dá)水平隨著LMWHC干預(yù)濃度的升高而降低，LMWHC干預(yù)濃度為1×103IU/L和1×104IU/L時(shí)，與未用LMWHC干預(yù)的細(xì)胞比較，差異有顯著性(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

注：A：不同濃度LMWHC干預(yù)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞后，培養(yǎng)基上清中MMP-2的表達(dá)水平。B：不同濃度LMWHC干預(yù)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞后，培養(yǎng)基上清中TIMP的表達(dá)水平。與對(duì)照組比較，*P<0.05。圖4 LMWHC對(duì)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)基上清中MMP-2和TIMP的影響Note. A: Expression level of MMP-2 in the supernatant of culture medium after different concentrations of LMWHC on mouse trophoblastic cells. B: Expression level of TIMP in supernatant of culture medium after different concentrations of LMWHC on mouse trophoblastic cells. Compared with control group, *P<0.05.Figure 4 Effects of LMWHC on MMP-2 and TIMP in the supernatant of culture medium of mouse trophoblast cells

2.5 LMWHC對(duì)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞MMP-2和TIMP-2蛋白水平表達(dá)的影響

LMWHC不同濃度干預(yù)滋養(yǎng)層細(xì)胞24 h后，滋養(yǎng)層細(xì)胞上清液中MMP-2表達(dá)水平較未用LMWHC干預(yù)的細(xì)胞均升高(P<0.05)，當(dāng)LMWHC干預(yù)濃度為1×103IU/L時(shí)，MMP-2表達(dá)水平最高。滋養(yǎng)層細(xì)胞上清液中TIMP-2表達(dá)水平隨著LMWHC干預(yù)濃度的升高而降低，LMWHC干預(yù)濃度為1×103IU/L和1×104IU/L時(shí)，與未用LMWHC干預(yù)的細(xì)胞比較，差異有顯著性(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

注：A：不同濃度LMWHC干預(yù)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞后，培養(yǎng)基上清中MMP-2的表達(dá)水平。B：不同濃度LMWHC干預(yù)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞后，培養(yǎng)基上清中TIMP的表達(dá)水平。與對(duì)照組比較，*P<0.05。圖5 LMWHC對(duì)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)基上清中MMP-2和TIMP的影響Note. A: Expression level of MMP-2 in the supernatant of culture medium after different concentrations of LMWHC on mouse trophoblastic cells.B: Expression level of TIMP in the supernatant of culture medium after different concentrations of LMWHC on mouse trophoblastic cells. Compared with the control group, *P<0.05.Figure 5 Effects of LMWHC on MMP-2 and TIMP in supernatant of culture medium of mouse trophoblast cells

2.6 LMWHC對(duì)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞MMP-2和TIMP-2 mRNA水平表達(dá)的影響

注：A：不同濃度LMWHC干預(yù)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞后，培養(yǎng)基上清中MMP-2 mRNA表達(dá)水平。B：不同濃度LMWHC干預(yù)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞后，培養(yǎng)基上清中TIMP mRNA表達(dá)水平。與對(duì)照組比較，*P<0.05。圖6 LMWHC對(duì)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)基上清中MMP-2和TIMP的影響Note. A: MMP-2 mRNA expression level in the supernatant of culture medium after different concentrations of LMWHC on mouse trophoblast cells. B: TIMP mRNA expression level in the supernatant of culture medium after different concentrations of LMWHC on mouse trophoblastic cells. Compared with the control group, *P<0.05.Figure 6 Effects of LMWHC on MMP-2 and TIMP in supernatant of culture medium of mouse trophoblast cells

LMWHC不同濃度干預(yù)滋養(yǎng)層細(xì)胞24 h后，滋養(yǎng)層細(xì)胞上清液中MMP-2 mRNA表達(dá)水平較未用LMWHC干預(yù)的細(xì)胞均升高(P<0.05)，且當(dāng)LMWHC干預(yù)濃度為1×103IU/L時(shí)，MMP-2表達(dá)水平最高。滋養(yǎng)層細(xì)胞上清液中TIMP-2表達(dá)水平隨著LMWHC干預(yù)濃度的升高而降低，LMWHC干預(yù)濃度為1×103IU/L和1×104IU/L時(shí)，與未用LMWHC干預(yù)的細(xì)胞比較，差異有顯著性(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

3 討論

生殖是物種繁衍的重要生理過(guò)程，而相對(duì)低效率的妊娠對(duì)生殖造成嚴(yán)重影響。正常育齡期女性每個(gè)排卵周期妊娠成功的幾率僅在30%左右，妊娠失敗的原因主要為胚胎著床失敗[6]。盡管現(xiàn)代的體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)技術(shù)為不孕患者提供了妊娠機(jī)會(huì)，但I(xiàn)VF-ET的著床率也僅20%～30%，胚胎著床失敗仍是當(dāng)前生殖醫(yī)學(xué)的難題之一[7]。胚胎著床是否成功主要與影響配子或胚胎發(fā)育的因素、影響子宮內(nèi)膜容受性的因素、影響子宮的全身因素有關(guān)[8]。

LMWHC是肝素經(jīng)化學(xué)解聚或在酶的作用下產(chǎn)生的小分子片段，可通過(guò)抑制凝血因子Ⅱa和凝血酶Ⅹa活性發(fā)揮抗凝作用，同時(shí)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，使血液粘稠度降低，從而增加胎盤(pán)血液供應(yīng)，改善胎盤(pán)微循環(huán)，有利于胚胎生長(zhǎng)發(fā)育[9-10]。在產(chǎn)科中多用于妊娠合并癥、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的治療，且應(yīng)用于IVF-ET多次失敗患者，可有效改善妊娠結(jié)局[11-13]。

為探討LMWHC對(duì)胚胎著床的影響及其作用機(jī)制，本研究構(gòu)建了妊娠小鼠模型，給予LMWHC干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LMWHC組妊娠D6和D9小鼠的著床位點(diǎn)數(shù)均多于對(duì)照組，差異有顯著性(P<0.05)，提示LMWHC對(duì)胚胎著床具有促進(jìn)作用。滋養(yǎng)細(xì)胞源于胚胎外的滋養(yǎng)層，可分化為胎盤(pán)和胎膜。滋養(yǎng)細(xì)胞在胎盤(pán)著床過(guò)程中分化為2個(gè)不同亞群，即絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞和絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞。其中絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞能通過(guò)母體蛻膜和子宮血管的侵入降解并重建子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)。滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮內(nèi)膜不足會(huì)影響胚胎著床以及胎盤(pán)血管重塑，導(dǎo)致各種妊娠期并發(fā)癥以及胎兒發(fā)育遲緩、流產(chǎn)、死胎發(fā)生[14-15]。Chen[16]等人發(fā)現(xiàn)LMWH對(duì)孕早期滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲能力具有調(diào)節(jié)作用，2.5×102IU/L和2.5×103IU/L組滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)，2.5×104IU/L和2.5×105IU/L組滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力則受到抑制。但Quenby[17]等人研究結(jié)果顯示，無(wú)論是2.5×102IU/L還是2.5×103IU/L的LMWH對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力均無(wú)明顯作用。鑒于此，本研究對(duì)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，并采用不同濃度LMWHC處理細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)不同濃度LMWHC處理后，滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲力均明顯增強(qiáng)，且在LMWHC濃度為1×103IU/L時(shí)最強(qiáng)，提示一定濃度范圍內(nèi)的LMWHC可通過(guò)增強(qiáng)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲力而促進(jìn)胚胎著床。不同研究結(jié)果存在差異，可能與選取樣本、實(shí)驗(yàn)方法或取樣部位不同有關(guān)。

滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲力主要受其分泌的MMPs調(diào)節(jié)，MMP-2是妊娠早期滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的最主要蛋白酶，可將子宮內(nèi)膜細(xì)胞外基質(zhì)中的IV型膠原降解，促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵入。TIMP是MMP的抑制物，兩者的相互制約對(duì)于滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力的控制起到重要作用[18-19]。Chen[16]等人雖指出LMWHC可調(diào)節(jié)孕早期滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲能力，但未對(duì)其調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)一步探索，本研究采用不同濃度LMWHC處理小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞，通過(guò)ELISA法、Western blot和RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞上清液中MMP-2和TIMP-2的蛋白和mRNA水平表達(dá)情況，結(jié)果顯示采用LMWHC處理的細(xì)胞上清中MMP-2表達(dá)水平較未處理細(xì)胞明顯上升，而TIMP-2表達(dá)水平較未處理細(xì)胞明顯下降，以上結(jié)果提示LMWHC可能是通過(guò)上調(diào)MMP-2表達(dá)同時(shí)下調(diào)TIMP-2表達(dá)而增強(qiáng)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲力。

綜上所述，LMWHC對(duì)小鼠胚胎著床具有積極作用，其機(jī)制可能與LMWHC調(diào)控MMP-2和TIMP-2表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲力有關(guān)。當(dāng)然，影響滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲力的因素眾多，LMWHC是否與其他細(xì)胞因子的表達(dá)以及信號(hào)通路有關(guān)，還需進(jìn)一步研究。