賈松華，王 洪，魏 杰，岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

貓(cat;Feliscatus)隸屬哺乳綱(Mammals)、食肉目(Carnivora)、貓科(Felidae)、貓屬(Felis)。染色體數(shù)2n=38。目前，貓?jiān)谌澜绲膿碛辛考s6億只[1]，為其在科研方面的應(yīng)用提供了豐富的貓資源。據(jù)OMIA(ONLINE MENDELIAN INHERITANCE IN ANIMALS)網(wǎng)站的統(tǒng)計(jì)分析，截止2018年6月，在貓中發(fā)現(xiàn)的與人類同源的遺傳性疾病有208種。同時(shí)，貓使人類更深入地了解了一些急性感染性疾病的相關(guān)機(jī)理和生物學(xué)特性。歷史上很多致癌基因的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最初是在攜帶有白血病病毒的貓動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)的[2]；轉(zhuǎn)基因鼠和貓是研究人類免疫缺陷病毒(HIV)時(shí)應(yīng)用最多的兩類非靈長(zhǎng)類動(dòng)物[3- 4]；感染有冠狀病毒(FeCoV)的貓對(duì)于研究SARS的臨床癥狀是一個(gè)重要的切入點(diǎn)[2]。此外，貓是研究神經(jīng)生理學(xué)，藥理學(xué)的熱門動(dòng)物。它是我國藥典在檢查藥品的降壓物質(zhì)時(shí)指定的實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物[5]，也是研究腦神經(jīng)以及眼科的絕佳材料[6]。

鑒于貓豐富的科學(xué)實(shí)驗(yàn)價(jià)值，有必要對(duì)貓進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化培育。在貓的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化進(jìn)程中，初篩過的貓必須進(jìn)行嚴(yán)格的微生物凈化、遺傳及飼養(yǎng)環(huán)境等因素的控制。目前，國外對(duì)貓群體的飼養(yǎng)繁育、質(zhì)量控制、品系培育等經(jīng)驗(yàn)豐富。例如，賓夕法尼亞大學(xué)在1974年構(gòu)建了RCAM(Referral Center for Animal Models of Human Genetic Disease)系統(tǒng)，其保存的貓疾病模型在研究與人類同源的遺傳性疾病中具有不可或缺的位置[7]。NIH(National Institutes of Health)自1978年在其動(dòng)物中心建立了封閉群貓種群[8]。蘇黎世大學(xué)目前已培育有SPF級(jí)的實(shí)驗(yàn)用貓[9]。與之相比，我國實(shí)驗(yàn)用貓資源緊缺，多數(shù)實(shí)驗(yàn)用貓購自市場(chǎng)，經(jīng)隔離檢疫、嚴(yán)格篩選后使用；目前為止，我國90%以上的教學(xué)科研實(shí)驗(yàn)用貓都是從商販或“收購型飼養(yǎng)場(chǎng)”購買。其來源混雜，遺傳背景模糊，所攜帶微生物不明等情況，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、科學(xué)性以及重現(xiàn)性都有直接影響[10-12]。為了提高實(shí)驗(yàn)用貓的質(zhì)量，使其更易于做科研和生產(chǎn)，我國的一些單位近年來也建立了實(shí)驗(yàn)用貓的群體。比如，華北制藥廠定向培育成了虎斑貓的常染色體隱性突變品系—虎皮貓[13]；自2003年大連醫(yī)科大學(xué)也開始了貓的封閉飼養(yǎng)繁育[14]。

微衛(wèi)星[15](microsatellite)又稱為短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat, STR)或稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats, SSR)，是指以少數(shù)幾個(gè)核苷酸(一般為1～6 bp)為單位，經(jīng)多次重復(fù)(重復(fù)10～60次左右)單位組成的簡(jiǎn)單多次串聯(lián)重復(fù)序列，如(CA)n，(TG)n。由于微衛(wèi)星具有分布廣泛且均勻、多態(tài)性豐富、通用性及保守性等特點(diǎn)，使其迅速成為了第二代DNA遺傳標(biāo)記，在小型豬[16]，豚鼠[17]，兔[18]等多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量檢測(cè)中廣泛應(yīng)用。為了能夠在貓的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化進(jìn)程中提供遺傳控制的技術(shù)支持，本課題組通過檢索國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，備選了74個(gè)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)用貓的遺傳質(zhì)量檢測(cè)。最終，本研究成功篩選出了31個(gè)富含多態(tài)點(diǎn)且均勻分布于18對(duì)常染色體上的微衛(wèi)星位點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)所用家貓、暹羅貓血液樣本均由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。經(jīng)舒泰麻醉后，無菌采集前肢抗凝血，冷鏈運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，并于4℃保存?zhèn)溆?。家貓的樣本量?6只，暹羅貓的樣本量為10只。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中遵循3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

Bio-Rad PowerPar Basic型電泳儀，NanoPhotometer 型DNA微量分析儀，ABI VeritiTM 96型PCR擴(kuò)增儀， GelLogic 212Pro型凝膠成像分析系統(tǒng)。

DNA marker、Taq酶、dNTP和10×PCR buffer均購自Takara公司。ExRed核酸染料由莊盟生物提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 貓基因組DNA的制備：

參照《分子克隆指南》[19]及Loparev VN[20]等所提出的方案，用NaI手提法提取血凝塊基因組DNA，具體步驟詳見李芳芳等[21]采用的血凝塊手提法。

提取后的基因組DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用微量分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度。最后將DNA適量稀釋成50～100 ng/μL作為DNA模板，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)的選擇與引物的合成

本課題組根據(jù)Lipinski等[22]推薦的9個(gè)位點(diǎn)，衣帥等[23]人選出的用于華北制藥廠虎皮貓遺傳檢測(cè)的31個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，以及從GeneBank中篩選出的一些位點(diǎn)，共計(jì)74個(gè)微衛(wèi)星作為本次實(shí)驗(yàn)的備選位點(diǎn)。引物委托上海生工有限公司合成。

1.3.3 PCR及瓊脂糖凝膠電泳

PCR擴(kuò)增選用20 μL的反應(yīng)體系，其中：10×PCR buffer(Mg2+Plus)2 μL, dNTP(各2.5 mmol/L)1 μL, 上下游引物(100 μmol/L)各1 μL，Taq酶(5 U/μL)0.2 μL，模板(50～100 ng/μL)1 μL，滅菌水(ddH2O)13.8 μL。

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，退火30 s；72℃延伸30 s；35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min；用2.5%的瓊脂糖、電壓120 V、30 min，ExRed(1 μg/mL)染色，電泳PCR產(chǎn)物，進(jìn)而篩選出擴(kuò)增效果好的產(chǎn)物進(jìn)行STR掃描。

初選的退火溫度是參考相關(guān)文獻(xiàn)或引物合成公司推薦的退火溫度，挑選擴(kuò)增效果不好的引物進(jìn)行退火溫度的梯度優(yōu)化。

1.3.4 STR掃描

首先在ABI3730XL DNA測(cè)序儀上(Applied Biosystems,Inc.)將PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳分型，并通過GeneMapper4.0(Applied Biosystems,Inc.)軟件判讀每個(gè)位點(diǎn)各等位基因?qū)?yīng)的擴(kuò)增片段大小，隨后，用自主編寫的軟件將每個(gè)位點(diǎn)等位基因的擴(kuò)增片段從小到大排序?yàn)?1、02、03、04等，之后將每個(gè)樣本的基因型轉(zhuǎn)為0101、0203、0202、0103等形式(無擴(kuò)增條帶的樣本基因型記為0000)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

每個(gè)樣本的基因型轉(zhuǎn)為0101、0203、0202等形式后輸入在線軟件Genepop，對(duì)各位點(diǎn)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡分析并檢測(cè)雜合子缺失情況。并用該軟件的類型轉(zhuǎn)換功能將每個(gè)樣本的基因型轉(zhuǎn)換為 PopGen1.32軟件所需格式。PopGen1.32可計(jì)算觀測(cè)等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、觀測(cè)雜合度、期望雜合度等指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA瓊脂糖檢測(cè)結(jié)果

將NaI手提法提取的基因組DNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),凝膠成像系統(tǒng)拍照后的電泳圖顯示，DNA條帶清晰、明亮、無明顯拖尾現(xiàn)象(如圖1所示)，滿足該實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 PCR反應(yīng)中退火溫度的優(yōu)化結(jié)果

以初選的退火溫度進(jìn)行兩個(gè)樣本的PCR反應(yīng)時(shí)，有56個(gè)位點(diǎn)得到了有效擴(kuò)增，另有18個(gè)位點(diǎn)的凝膠電泳圖存在條帶模糊、有非特異性擴(kuò)增或者沒有目的條帶擴(kuò)增等現(xiàn)象，本研究針對(duì)這18個(gè)位點(diǎn)的退火溫度進(jìn)行了梯度優(yōu)化。13個(gè)位點(diǎn)優(yōu)化后擴(kuò)增出了理想條帶；有4個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增效果變化不明顯；另有1個(gè)位點(diǎn)經(jīng)退火溫度優(yōu)化后仍沒有擴(kuò)增出目的條帶。圖2為FCA1264、FCA996兩位點(diǎn)的退火溫度優(yōu)化電泳圖。

注：編號(hào)S1～S6為暹羅貓DNA；編號(hào)D1～D6為家貓DNA。圖1 部分貓基因組DNA的1%瓊脂糖凝膠電泳圖Note. S1->S6: Numbers of Siamese cat genomic DNA; D1->D6: Numbers of domestic cat genomic DNA.Figure 1 1% Gel electrophoretogram of cat genomic DNA

注：M為marker，分子量從大到小依次為500、400、300、200、100 bp。圖示編號(hào)為PCR反應(yīng)時(shí)所用退火溫度(℃)。1～5泳道所用引物為FCA1264；6～10泳道所用引物為FCA996。圖2 FCA1264、FCA996位點(diǎn)的退火溫度梯度優(yōu)化電泳結(jié)果Note. M is the marker (500, 400, 300, 200, and 100 bp). Numbers represent annealing temperatures (°C). The former five temperatures were used for the FAC1264 locus, and the later five temperatures were used for the FAC996 locus.Figure 2 Annealing temperature gradients of FCA1264 and FCA996 loci

2.3 微衛(wèi)星位點(diǎn)的初步篩選結(jié)果

備選74對(duì)引物的PCR產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳后，其中41對(duì)引物(占總數(shù)的55.41%)可檢測(cè)到個(gè)體間等位基因的多態(tài)性，有15對(duì)引物(占總數(shù)的20.27%)的擴(kuò)增產(chǎn)物為單態(tài)，8對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為非特異性條帶，10對(duì)引物尚得不到穩(wěn)定擴(kuò)增。圖3為FCA221位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜。

2.4 STR掃描結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)通過毛細(xì)管凝膠電泳進(jìn)行了基因分型，成功分型率為97.3%。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行STR掃描時(shí)，會(huì)出現(xiàn)兩種情況的波形，判讀方法如下：若樣品為雜合子，則有兩個(gè)獨(dú)立的主峰(如圖4)；只有一個(gè)主峰的樣品為純合子(如圖5)?？梢勒辗迕娣e的大小判斷主峰。圖4、圖5的橫坐標(biāo)表示擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小。圖中所示峰值越高，表示該產(chǎn)物片段量越多。

注：M為marker，分子量從大到小依次為500、400、300、200、100 bp；序號(hào)1～10為暹羅貓，序號(hào)11～26為家貓。圖3 FCA221位點(diǎn)PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Note. 1-10: M represents the marker (500, 400, 300, 200, and 100 bp). 1-10: Numbers of Siamese cats; 11-26: Numbers of domestic cats.Figure 3 Agarose gel electrophoresis of PCR products from the FCA221 locus

注：第10號(hào)貓的等位基因大小為145 bp和173 bp，屬于雜合子。圖4 FCA221位點(diǎn)在圖3對(duì)應(yīng)的10號(hào)貓STR掃描結(jié)果Note. The alleles of cat 10 were 145 and 173 bp, which were heterozygous.Figure 4 STR scanning at the FCA221 locus in cat 10

注：第11號(hào)貓的等位基因大小為173 bp，屬于純合子。圖5 FCA221位點(diǎn)在圖3對(duì)應(yīng)的11號(hào)貓STR掃描結(jié)果Note. The allele of cat 11 was 173 bp, which was homozygous.Figure 5 STR scanning at the FCA221 locus in cat 11

2.5 最終篩選的微衛(wèi)星位點(diǎn)結(jié)果

經(jīng)兩種方法逐步篩選備選的74對(duì)引物時(shí)，共得到55個(gè)富含多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)。在貓的每條常染色體(除了A1、B1染色體)上適當(dāng)選擇1～2個(gè)多態(tài)性較高的STR位點(diǎn)，并最終選取了31對(duì)擴(kuò)增效果較好、多態(tài)性較高的微衛(wèi)星引物，作為實(shí)驗(yàn)用貓遺傳質(zhì)量檢測(cè)的一套引物。表1為篩選的31個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的編號(hào)、染色體位置、等位基因范圍、退火溫度等相關(guān)信息。終選的31個(gè)引物在貓群體中的擴(kuò)增條帶范圍為124～385 bp，所用退火溫度范圍為55℃～60℃，共檢測(cè)出261個(gè)等位基因，各位點(diǎn)的等位基因數(shù)5～20個(gè)不等，平均等位基因數(shù)為8.42。

3 討論

眾多實(shí)驗(yàn)結(jié)果[24-27]表明，本課題組所選用的STR標(biāo)記多態(tài)性高，呈共顯性，等位基因的變化幅度小，易實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增和凝膠電泳。在收集樣本時(shí)，可選用非損傷方式獲得，提取的DNA純度要求不高。因此，微衛(wèi)星具有很強(qiáng)的實(shí)用性，屬于遺傳質(zhì)量檢測(cè)的優(yōu)選標(biāo)記。微衛(wèi)星標(biāo)記的獲得方式有四種：1)通過檢索DNA序列數(shù)據(jù)庫獲得STR；2)借助與所研究物種親緣關(guān)系較近的物種尋求STR；3)從構(gòu)建的基因組文庫中篩選含STR的陽性克?。?)利用RAPD標(biāo)記獲取STR。本次實(shí)驗(yàn)選用第一種方式獲得微衛(wèi)星標(biāo)記。該方法簡(jiǎn)單易行且快速經(jīng)濟(jì)，但所得微衛(wèi)星信息有限不如基因組文庫，無法反映整個(gè)貓的基因組狀況。

備選的STR在PCR擴(kuò)增時(shí)有些位點(diǎn)存在等位基因無法擴(kuò)增，非特異性擴(kuò)增等現(xiàn)象。需要對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，從而剔除無法擴(kuò)增以及非特異性擴(kuò)增的位點(diǎn)，最終選出相對(duì)理想的高多態(tài)性STR位點(diǎn)。目前，國內(nèi)外對(duì)篩選微衛(wèi)星并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)可尋，一般通過衡量等位基因數(shù)目取舍備選的微衛(wèi)星位點(diǎn)[28-29]。Barker[30]在全球家畜品種間遺傳距離測(cè)定草案中提供的建議具有一定的參考價(jià)值。在檢測(cè)群體遺傳質(zhì)量時(shí)，Barker認(rèn)為：1)所用的每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)至少有4個(gè)等位基因；2)為了兼顧檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和經(jīng)濟(jì)性，所篩選的微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)不少于26個(gè)；3)位點(diǎn)之間不連鎖，所選的位點(diǎn)盡量均勻分布每條染色體上。

表1 31個(gè)貓微衛(wèi)星位點(diǎn)的相關(guān)信息Table 1 Characteristics of 31 microsatellite loci in the cats

本實(shí)驗(yàn)采用兩種方法逐步篩選備選的74對(duì)引物。第一步選用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳初篩，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果初步判定所選引物是否合適以及PCR擴(kuò)增是否成功,即初步分析引物適用性。剔除無法擴(kuò)增、非特異性擴(kuò)增或者不能穩(wěn)定擴(kuò)增的位點(diǎn)。挑選了56個(gè)條帶清晰，具有特異性擴(kuò)增的位點(diǎn)以便進(jìn)一步STR掃描。電泳時(shí)有些位點(diǎn)存在引物二聚體現(xiàn)象，但其片段小于100 bp，易與特異條帶區(qū)分。初篩所用瓊脂糖凝膠電泳法分離效果不是很好，難以區(qū)分小于10 bp的片段，多數(shù)STR位點(diǎn)的等位基因變化幅度為20～40 bp，瓊脂糖凝膠最多僅能檢出3～4個(gè)等位基因。理論上可通過增加瓊脂糖凝膠的濃度提高分離效果，但濃度太高不易灌制凝膠，無法提高分辨率。但瓊脂糖凝膠電泳省時(shí)省力經(jīng)濟(jì)，不失為初篩引物的有效方法。隨后，將挑選的56個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行STR掃描。STR掃描屬于一種新型的基因分型技術(shù)，不僅能有效判讀樣品的純合和雜合狀況，還可以將相差1 bp的DNA片段區(qū)分開，準(zhǔn)確測(cè)定等位基因的片段大小。該方法靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、易實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，但在檢測(cè)前要求熒光標(biāo)記引物，檢測(cè)成本較高。本實(shí)驗(yàn)采用瓊脂糖凝膠電泳初篩后再進(jìn)行STR掃描可適當(dāng)降低成本。本實(shí)驗(yàn)綜合考慮擴(kuò)增條帶的特異性、清晰度、穩(wěn)定性以及微衛(wèi)星位點(diǎn)在個(gè)體間的多態(tài)性，共得到55個(gè)富含多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)。為了兼顧遺傳檢測(cè)成本和準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)在貓的每條常染色體(除了A1、B1染色體)上適當(dāng)選擇1～2個(gè)多態(tài)性較高的STR位點(diǎn)。最終獲得了31對(duì)擴(kuò)增效果較好,多態(tài)性較高的微衛(wèi)星引物，推薦為實(shí)驗(yàn)用貓遺傳質(zhì)量檢測(cè)的一套首選引物。但篩選的位點(diǎn)是否完全適合用于實(shí)驗(yàn)用貓的群體遺傳檢測(cè)，尚需在實(shí)踐中應(yīng)用驗(yàn)證。此外，由于實(shí)驗(yàn)所用樣本數(shù)量有限，還不能完全代表貓的多態(tài)性。在今后實(shí)踐中，應(yīng)增加不同來源的貓品種樣本量，發(fā)掘新的多態(tài)性位點(diǎn)，以確保準(zhǔn)確描述實(shí)驗(yàn)用貓的遺傳質(zhì)量。