張 婷，王 穎，王 莉

(1.河北省人民醫(yī)院產(chǎn)科, 石家莊 050000；2. 河北北方學(xué)院研究生院, 河北 張家口 075000)

大鼠的動情周期平均4～5 d，是一個動態(tài)過程，一般分為四個階段，包括發(fā)情前期，發(fā)情期，發(fā)情后期和發(fā)情間期[1-2]。大鼠動情周期可以作為衡量下丘腦-垂體-卵巢生殖軸完整性的有用指標，確定雌鼠動情周期的階段對選擇適宜的交配時機，評估大鼠內(nèi)分泌狀態(tài)都是非常重要的[2-4]。從雌鼠的行為和外觀上不能區(qū)分動情周期，陰道脫落細胞可以評估雌鼠動情周期，通常采用陰道涂片染色后觀察細胞形態(tài)來確定這個動態(tài)過程[5-6]。陰道涂片染色方法有很多種，McLean等[7]認為結(jié)晶紫染色簡單易行，可以用于區(qū)分小鼠動情周期?？焖俑锾m氏染色主要成分為結(jié)晶紫溶液，但是用時比結(jié)晶紫染色少，是人類常用的陰道脫落細胞染色方法，到目前為止還沒有人將其用于大鼠陰道涂片染色，因其操作簡便，快速，適合進行大規(guī)模的陰道涂片檢查，本課題組用快速革蘭氏染色法和結(jié)晶紫染色法對Sprague Dawley (SD)大鼠陰道脫落細胞進行染色，觀察細胞形態(tài)，區(qū)分大鼠的動情周期。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

10～13 周齡雌性SD大鼠20只，體重216～234 g，平均(225±6)g，清潔級，購自河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心[SCXK(冀)2013-1-003]。大鼠在河北醫(yī)科大學(xué)動物房飼養(yǎng)[SYXK(冀)2013-0026]，屏障環(huán)境，室溫：20℃～25℃，相對濕度：45%～60%，每日12 h光照，12 h黑暗，普通鼠糧喂養(yǎng)，飲用自來水。動物實驗過程遵循3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

快速革蘭氏染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，主要成分：1號龍膽紫液(龍膽紫和乙醇)、2號碘溶液(碘和碘化鉀)、3號脫色液(丙酮和乙醇)、4號沙黃溶液(沙黃和乙醇)，0.1%龍膽紫溶液自制(稱取結(jié)晶紫粉末0.1 g，溶于100 mL的雙蒸水中，攪拌均勻即可)。主要儀器為正置顯微鏡(ECLIPSE E100，Nikon，Japan)。

1.3 實驗方法

1.3.1 制作大鼠陰道涂片

用無菌棉花和牙簽的鈍頭制作棉簽，并用無菌生理鹽水將其浸濕，取出干凈的載玻片用5 mL注射器滴2～3滴生理鹽水備用。每天上午8:00～9:00將20只SD雌鼠從鼠籠中取出，并將其放在籠蓋上，一只手捉住大鼠的尾巴并輕輕提起，大鼠會用前爪抓住籠蓋，暴露陰道口，用生理鹽水濕潤的無菌棉簽擦拭陰道口后，將事先準備好的棉簽插入大鼠陰道內(nèi)0.5～1 cm，輕柔旋轉(zhuǎn)1～2圈，將棉簽均勻涂在事先準備好的干凈的載玻片上的鹽水中進行涂片，每次兩張，分別做結(jié)晶紫染色和快速革蘭氏染色，連續(xù)6 d。

1.3.2 陰道涂片染色方法

(1)快速革蘭氏染色：①涂片自然風(fēng)干后，用移液器將50 μL 1號溶液滴在載玻片上，靜置10 s，用蒸餾水將1號溶液緩慢沖洗干凈；②將50 μL 2號溶液滴在載玻片上，靜置10 s，用蒸餾水將2號溶液緩慢沖洗干凈；③將50 μL 3號脫色液滴在載玻片上進行脫色，靜置10 s，用蒸餾水將3號溶液緩慢沖洗干凈；④將50 μL 4號溶液滴在載玻片上，靜置10 s，用蒸餾水將4號溶液緩慢沖洗干凈，自然風(fēng)干。

(2)結(jié)晶紫染色：①涂有大鼠陰道脫落細胞的載玻片風(fēng)干后用無水乙醇固定10 min；②將50 μL 0.1%龍膽紫溶液滴在載玻片上，靜置1 min；③將載玻片放入蒸餾水中水洗1 min，再用干凈的蒸餾水沖洗5 s，自然風(fēng)干。

1.3.3 大鼠動情周期判定標準

在10倍鏡下觀察每個涂片中的細胞形態(tài)，依據(jù)細胞類型區(qū)分SD大鼠動情周期。首先評估白細胞的存在，發(fā)情間期和發(fā)情后期的一個顯著特征是白細胞大量存在，如果白細胞難以觀察到，則該階段是發(fā)情前期或發(fā)情期[1]。 發(fā)情前期平均持續(xù)14 h，這個階段存在有核上皮細胞和無核角化細胞，其中圓形有核上皮細胞占主要地位[8]；發(fā)情期持續(xù)24～48 h，滿視野可見無核角化上皮細胞；發(fā)情后期只有6～8 h，主要為無核角化上皮細胞和白細胞；發(fā)情間期持續(xù)時間為48～72 h，這個階段的特點是大量白細胞、少量無核角化上皮細胞(也可能沒有)、大小不一有核上皮細胞[3,8]。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)晶紫染色

SD大鼠性周期不同階段陰道涂片結(jié)晶紫染色結(jié)果如下：(1)發(fā)情前期：涂片中主要為圓形或橢圓形有核細胞，細胞核被染成深紫色，細胞質(zhì)呈淺紫色，細胞膜有時欠完整，也可見無核角化上皮細胞，呈淺紫色(圖1A)；(2)發(fā)情期：涂片中滿視野呈現(xiàn)淺紫色的不規(guī)則多邊形無核角化細胞(圖1B)；(3)發(fā)情后期：可見大量白細胞和少量無核角化細胞，白細胞小而圓，呈深紫色，白細胞形態(tài)有時有輕微變形(圖1C)；(4)發(fā)情間期：涂片中主要是白細胞，有核細胞和無核角化細胞同時存在，無核角化細胞和有核細胞細胞質(zhì)呈淺紫色，白細胞和有核細胞細胞核呈深紫色(圖1D)。

2.2 快速革蘭氏染色

SD大鼠性周期不同階段陰道涂片快速革蘭氏染色結(jié)果如下：(1)發(fā)情前期：有核細胞為圓形或橢圓形，細胞核被染成紫紅色，細胞核輪廓清晰，細胞質(zhì)被染成玫紅色，細胞膜完整，整體層次感明顯，易于區(qū)分，同時存在玫紅色的無核角化細胞(圖2A)；(2)發(fā)情期：涂片中滿視野為玫紅色的無核角化細胞，形態(tài)呈不規(guī)則的多邊形(圖2B)；(3)發(fā)情后期：大量白細胞和少量無核角化細胞，白細胞為小的圓形細胞，呈深紅色，細胞形態(tài)清晰(圖2C)；(4)發(fā)情間期：白細胞，有核細胞和無核角化細胞同時存在(圖2D)。

SD大鼠陰道涂片通過結(jié)晶紫染色和快速革蘭氏染色都能顯示出細胞形態(tài)，區(qū)分細胞類型，很好的識別大鼠動情周期的階段。結(jié)晶紫染色法用時約12 min，快速革蘭氏染色法用時小于1 min。

注： A：發(fā)情前期；B：發(fā)情期；C：發(fā)情后期；D：發(fā)情間期。圖A黑色箭頭和圖D紅色剪頭所指是有核細胞，細胞核染成深紫色，細胞質(zhì)染成淺紫色。圖B黑色箭頭和圖D藍色箭頭所指是無核角化細胞。圖C和圖D黑色箭頭所指是白細胞。圖1 陰道涂片結(jié)晶紫染色結(jié)果(×10)Note.Vaginal smears with crystal violet staining at various phases of the estrous cycle (A-D). Proestrus (A), estrus (B), metestrus (C), and diestrus (D). Black arrowhead in A and red arrowhead in D indicate nucleated epithelial cells. The nucleus was stained deep purple, and the cytoplasm was stained lilac. Black arrowhead in B and blue arrowheads in C and D indicate cornified squamous epithelial cells. Black arrowhead in D indicates leukocytes.Figure 1 The results of crystal violet staining of the rat vaginal smears

注：A：發(fā)情前期；B：發(fā)情期；C：發(fā)情后期；D：發(fā)情間期。圖A黑色箭頭和圖D紅色剪頭所指是有核細胞，細胞核染成紫紅色，細胞質(zhì)染成粉紅色。圖B黑色箭頭和圖C藍色箭頭所指是無核角化細胞。圖C和圖D黑色箭頭所指是白細胞。圖2 快速革蘭氏染色結(jié)果(×10)Note. Vaginal smears with rapid Gram staining at various phases of the estrous cycle (A-D). Proestrus (A), estrus (B), metestrus (C), and diestrus (D). Black arrowhead in A and red arrowhead in D indicate nucleated epithelial cells. The nucleus was stained amaranth, and the cytoplasm was stained rose red. Black arrowhead in B and blue arrowhead in D indicate cornified squamous epithelial cells. Black arrowhead and blue arrowhead in C indicate a leukocyte and cornified squamous epithelial cell, respectivelyFigure 2 The results of rapid Gram staining of the rat vaginal smears

3 討論

大鼠的動情周期主要通過對大鼠陰道涂片染色后區(qū)分細胞類型來識別[9]。蘇木素-伊紅(HE)染色是基本的組織染色方法，也用于細胞染色，染色結(jié)果背景清楚，細胞形態(tài)清晰，細胞核藍染，細胞質(zhì)呈粉紅色，但是對染色技術(shù)要求較高，染色時間或是鹽酸酒精脫色時間控制不好，染色失敗率高[10]。巴氏染色也用于陰道細胞學(xué)染色，尤其是在人類中作為篩查宮頸癌的方法(即巴氏涂片)，這種染色方法提供更好的細胞核染色細節(jié)并使細胞質(zhì)呈現(xiàn)橙色、粉紅色或藍色，便于區(qū)分細胞角化的程度，但是這種染色需要多色染料，方法復(fù)雜[3]。大鼠動情周期的確定不需要這些細節(jié)水平，因此HE染色或是巴氏染色不適于用于大鼠陰道涂片染色。大鼠陰道涂片染色常用改良吉姆薩染色、甲苯胺藍染色、瑞士染色、美蘭染色，染色原理都是堿性染料使細胞核著色[3,5,10]，結(jié)晶紫染色、快速革蘭氏染色也是利用此特點對大鼠陰道細胞進行染色。

本課題組通過對大鼠陰道涂片進行結(jié)晶紫染色和快速革蘭氏染色后可以檢測到3種細胞：有核上皮細胞，呈圓形或橢圓形，細胞質(zhì)染色較輕，細胞核染色深；角化細胞染色均勻，呈多邊形，沒有細胞核；白細胞染色深，呈圓形，形態(tài)小，10倍鏡下不能觀察到細胞核。本課題組通過染色后觀察細胞形態(tài)識別大鼠動情周期各個階段，發(fā)情前期：主要為有核細胞，也存在無核角化細胞；發(fā)情期：可見成片的無核角化細胞；發(fā)情后期：大量白細胞和少量無核角化細胞；發(fā)情間期：白細胞，有核細胞和無核角化細胞同時存在。與王潔等[11]人通過分析陰道涂片中3種細胞總量區(qū)分大鼠動情周期的四個階段結(jié)果基本一致，但是本課題組通過染色發(fā)現(xiàn)發(fā)情前期和發(fā)情期不存在白細胞，這與文獻報道的一致[3,7]。陰道涂片染色法與陰道涂片不染色進行細胞計數(shù)相比，染色后細胞形態(tài)更為清晰，易于區(qū)分，而且染色法區(qū)分大鼠動情周期簡單、直觀、節(jié)省時間，通過細胞計數(shù)后再進行統(tǒng)計分析較為復(fù)雜。

本實驗通過對快速革蘭氏染色和結(jié)晶紫染色兩種方法的比較，發(fā)現(xiàn)這兩種染色方法都能清晰的顯示出有核上皮細胞、無核角化細胞和白細胞的形態(tài)，可以很好的識別SD大鼠動情周期的四個階段，而且這兩種方法操作簡單，易于掌握?？焖俑锾m氏染色法陰道細胞容易著色，形態(tài)清晰，色彩鮮明，層次感強烈，并且省略了無水乙醇固定的步驟，可以直接進行染色，操作簡單，用時不超過1 min，與結(jié)晶紫染色相比(最少12 min)節(jié)省了染色時間。與改良吉姆薩染色、甲苯胺藍染色、瑞士染色、美蘭染色、結(jié)晶紫染色相比，快速革蘭氏染色法同樣可以很好的識別雌鼠的動情周期，但是用時最短。本實驗為大鼠陰道涂片染色增加了一種簡便、易行的方法，實驗室中需要大規(guī)模的篩查大鼠動情周期時，應(yīng)用快速革蘭氏染色法，可以很大程度上節(jié)省時間和精力。