陳昕昶，陳嘉臻，張文宏

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染科，上海 200040

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的傳染性疾病。相比于敏感株，結(jié)核分枝桿菌耐藥株的傳播力是研究熱點(diǎn)之一[1]。本課題組前期收集了55株2003—2009年于重慶市肺科醫(yī)院診斷的泛耐藥結(jié)核分枝桿菌(extensively drug-resistantMycobacteriumtuberculosis，XDR-TB)菌株，但由于技術(shù)上的限制，2014年僅用傳統(tǒng)的多位點(diǎn)數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列(variable-number tandem-repeat，VNTR)分型對(duì)其傳播及成簇特征進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)XDR-TB的傳播率較高[2]。

VNTR分型方法因簡便易行、結(jié)果可讀性強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)室間可比性高，廣泛應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌的傳播研究[3-4]。近年來，隨著技術(shù)的進(jìn)步、測(cè)序成本的降低，全基因組測(cè)序(whole-genome sequencing，WGS)技術(shù)開始用于研究結(jié)核分枝桿菌的傳播，已有多項(xiàng)研究證明WGS較VNTR分型具有更高的分辨率[5-6]。但目前應(yīng)用WGS鑒定結(jié)核病傳播的研究主要集中于敏感菌株及歐美菌株[7-9]，我國研究較少[10]，且尚未在XDR-TB中進(jìn)行相關(guān)研究。因此，本研究應(yīng)用WGS對(duì)上述菌株進(jìn)行重新分析，并評(píng)價(jià)VNTR分型判斷XDR基因型分布及成簇特征的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2003—2009年重慶市肺科醫(yī)院診斷的55株XDR-TB菌株。該醫(yī)院于2003—2009年共診斷 2 727 例結(jié)核病，其中624例為多重耐藥結(jié)核分枝桿菌(multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosis，MDR-TB)，85例為XDR-TB(已去重)。2015年共回溯、成功復(fù)蘇、完成藥敏試驗(yàn)和VNTR分型的菌株有95株[2]。本次成功復(fù)蘇并完成WGS的XDR-TB菌株有55株。

1.2 研究方法

1.2.1菌株選取對(duì)55株XDR-TB菌株進(jìn)行復(fù)蘇，并進(jìn)行DNA抽提。

1.2.2VNTR分型對(duì)成功復(fù)蘇并完成WGS的55株菌株進(jìn)行9+3個(gè)位點(diǎn)的VNTR分型，納入的9個(gè)位點(diǎn)為QUB-11b、QUB-18、QUB-26、MIRU26、Mtub21、Mtub04、MIRU31、MIRU40、VNTR2372，3個(gè)高變位點(diǎn)為VNTR3232、VNTR3820、VNTR4120[11]。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠分析。

計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)重復(fù)序列的拷貝數(shù)，在VNTRplus在線分析平臺(tái)(http://www.VNTRplus.org/MIRU/index.faces)上，用UPGMA算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。具有完全相同MIRU-VNTR基因型的結(jié)核分枝桿菌分離株≥2株即被認(rèn)為成簇。

1.2.3WGS分型對(duì)所有菌株DNA進(jìn)行文庫構(gòu)建，基于Illumina X10平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，深度至少為200×，用Bowtie 2軟件將測(cè)序reads比對(duì)到H37Rv(NC_000962.3)參考序列，覆蓋率為 99.21%～99.89%。用SAMtools進(jìn)行SNP檢測(cè)，若某位點(diǎn)的突變型比例在80%以上即認(rèn)為是固定突變。分析菌株間的遺傳距離時(shí)，去除PE、PPE等高度重復(fù)區(qū)域，GC富集序列及耐藥相關(guān)基因SNP，且SNP需測(cè)得至少10個(gè)reads無正負(fù)鏈偏差?；赟NP結(jié)果，用MEGA 7軟件以最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以H37Rv為根。根據(jù)現(xiàn)有研究，規(guī)定遺傳距離相差不超過12個(gè)SNP為成簇，即有近期傳播關(guān)系[7,10]。

2 結(jié)果

2.1 菌株信息

本研究最終納入55株2003—2009年重慶市肺科醫(yī)院診斷為XDR-TB的菌株。當(dāng)時(shí)患者基本資料如下：平均年齡15～82(47±18)歲，其中男性21例(38.2%)。均有4個(gè)一線抗結(jié)核藥物[異煙肼(H)、利福平(R)、鏈霉素(S)、乙胺丁醇(E)]和3個(gè)二線抗結(jié)核藥物[氧氟沙星(O)、卡那霉素(K)、卷曲霉素(C)] 的表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果，耐藥分布特征為HRSOK 4例、HRSOC 2例、HRSOKC 5例、HRSEOK 10例、HRSEOC 6例、HRSEOKC 28例。

2.2 VNTR分型結(jié)果

55株結(jié)核分枝桿菌通過VNTR分型方法可分為45個(gè)基因型。39株為單一基因型，16株(29.1%)分別歸入6個(gè)基因簇，即C1、C2、C3、C4-1、C4-2、C4-3，每個(gè)簇分別含有5、2、3、2、2、2株分離株。用UPGMA算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。

2.3 WGS分型結(jié)果

根據(jù)SNP，將55株菌株分為2個(gè)譜系[12]，其中53株為Lineage 2(East-Asian)，2株(Q546、Q388)為Lineage 4(Euro-American)。

根據(jù)現(xiàn)有研究，規(guī)定遺傳距離相差不超過12個(gè)SNP為成簇，可將55株菌株中的20株(36.4%)分為5個(gè)簇，即W1、W2、W4、W5、W6，分別含有6、4、5、3、2株菌株，并用MEGA 7軟件以最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。

簇內(nèi)菌株間SNP差異個(gè)數(shù)為4～21個(gè)，平均相差(12.89±3.62)個(gè)SNP。5個(gè)簇簇內(nèi)SNP差異個(gè)數(shù)分別為7～21(平均13.9±3.6)、9～19(平均 11.3±3.9)、4～21(平均13.2±4.7)、12、7個(gè)。進(jìn)一步比較簇內(nèi)關(guān)系最接近的菌株，其兩兩之間相差的SNP個(gè)數(shù)為4～12個(gè)，平均(9.8±2.4)個(gè)。5個(gè)簇簇內(nèi)菌株與簇外其他菌株的SNP差異個(gè)數(shù)分別為 (341.9±120.1)、(288.9±120.3)、(290.0±138.5)、(285.2±123.3)、(351.0±82.5)個(gè)(表1)。

注：紅色框內(nèi)是用VNTR、WGS分型方法鑒定的簇，其中C簇是VNTR分型鑒定出的簇，W簇是WGS分型鑒定出的簇。

圖1基于VNTR分型方法構(gòu)建進(jìn)化樹

Fig.1PhylogenetictreebasedonVNTRtyping

2.4 VNTR分型與WGS分型結(jié)果比較

VNTR將55株菌分成6個(gè)簇，WGS分成5個(gè)簇，其中C1與W1、C2與W2、C4-1～C4-3與W4有對(duì)應(yīng)關(guān)系。

注：紅色框內(nèi)是用VNTR、WGS分型方法鑒定的簇，其中C簇是VNTR分型鑒定出的簇，W簇是WGS分型鑒定出的簇。

圖2基于WGS分型方法構(gòu)建進(jìn)化樹

Fig.2PhylogenetictreebasedonWGS

表1全基因組測(cè)序方法鑒定成簇的菌株及其SNP信息

Tab.1Clustersofstrainsidentifiedbywhole-genomesequencing

WGS簇菌株個(gè)數(shù)簇內(nèi)SNP差異最小值簇內(nèi)SNP差異最大值簇內(nèi)最近菌株間SNP差異個(gè)數(shù)簇內(nèi)SNP個(gè)數(shù)差異平均值與簇外菌株SNP差異個(gè)數(shù)組成W167217～1213.9±3.6341.9±120.1308、330、479、528、578、603W24919911.3±3.9288.9±120.3325、326、471、565W454214～1213.2±4.7290.0±138.5362、375、469、470、510W5312121212285.2±123.3374、468、531W627777351.0±82.5448、597

注：加粗的編號(hào)是WGS特有的菌株，未加粗的編號(hào)是兩種分型方法共有的菌株。

VNTR分型鑒定C1中的5株為一簇，WGS分型鑒定W1中的6株為一簇，兩種方法均將Q479、Q528、Q578、Q603這4株分為同一簇。但Q584僅被VNTR鑒定為C1簇，WGS提示其不成簇，且與W1中其他菌株至少相差30個(gè)SNP；Q308、Q330僅被WGS鑒定為W1，VNTR提示其不成簇，且與C1中其他菌株分別相差2和3個(gè)VNTR位點(diǎn)。

VNTR分型鑒定C2中的2株為一簇， WGS分型鑒定W2中的4株為一簇。W2包含了VNTR分型鑒定的C2中的Q471、Q565兩株，并在此基礎(chǔ)上多鑒定出Q325、Q326與其成簇，Q325、Q326與C2簇分別相差1和3個(gè)VNTR位點(diǎn)。

VNTR分型鑒定Q405、Q510為一簇，即C4-1；鑒定Q469、Q470為一簇，即C4-2；鑒定Q532、Q575為一簇，即C4-3。其中C4-1與C4-2相差1個(gè)VNTR位點(diǎn)，C4-3與其他兩個(gè)簇相差2個(gè)VNTR位點(diǎn)。WGS分型鑒定W4中的5株為一簇，W4中包含了C4-2的全部菌株(Q469、Q470)和C4-1中的Q510。此外，WGS還多鑒定出Q362、Q375與其成簇，這兩株與其他C4菌株相差1個(gè)VNTR位點(diǎn)。VNTR鑒定為一簇，但WGS提示不成簇的菌株中，C4-3中的Q532與Q575相差45個(gè)SNP；C4-1中的Q405與Q510相差29個(gè)SNP。

VNTR分型鑒定C3中的3株為一簇(Q352、Q376、Q398)，WGS提示其兩兩之間相差29、59、64個(gè)SNP，因此不成簇。此外，WGS新鑒定了2個(gè)簇，W5包含3株(Q374、Q468、Q531)，其兩兩之間相差12個(gè)SNP、2～3個(gè)VNTR位點(diǎn)；W6包含2株(Q448、Q597)， 相差7個(gè)SNP、 2個(gè)VNTR位點(diǎn)(表1～2)。

表2VNTR分型方法鑒定成簇的菌株及其SNP信息

Tab.2ClustersofstrainsidentifiedbyVNTRtyping

VNTR簇菌株個(gè)數(shù)簇內(nèi)SNP差異最小值簇內(nèi)SNP差異最大值簇內(nèi)最近菌株間SNP差異個(gè)數(shù)簇內(nèi)SNP差異個(gè)數(shù)平均值組成C15104010～3022.4±12.9479、528、578、584、603C229999471、565C33296429～5950.6±18.9352、376、398C4-1229292929405、510C4-2212121212469、470C4-3245454545532、575

注：加粗的編號(hào)是VNTR分型特有的菌株，未加粗的編號(hào)是兩種分型方法共有的菌株。

共有8株同時(shí)被兩種方法鑒定為成簇，8株僅VNTR鑒定其成簇，12株僅WGS鑒定其成簇，其余27株兩種方法均提示不成簇。VNTR與WGS分型的一致性為 63.6%(35/55)。與WGS相比，VNTR分型的特異度為 77.1%，靈敏度為 40.0%，陽性預(yù)測(cè)值為 50.0%，陰性預(yù)測(cè)值為 69.2%(表3)。

表3WGS與VNTR分型鑒定成簇的一致性比較

Tab.3ConsistencycomparisonbetweenWGSandVNTR

WGS成簇非成簇總計(jì)VNTR成簇8816非成簇122739總計(jì)203555

3 討論

VNTR分型與WGS分型相比，有20株成簇判斷結(jié)果不一致，其中8株僅VNTR鑒定其成簇，12株僅WGS鑒定其成簇。8株僅VNTR鑒定成簇的菌株中，錯(cuò)誤地將C3中的3個(gè)菌株分為一簇(Q352、Q376、Q398)，WGS提示Q398、Q352分別與Q376相差59、64個(gè)SNP。這一現(xiàn)象已被多項(xiàng)研究報(bào)道，即VNTR分型一致的簇內(nèi)SNP差異很大[6,13]，因此公認(rèn)在鑒定傳播時(shí)WGS比VNTR分辨率高。

12株僅WGS鑒定成簇的菌株中，W1中的Q308和Q330、W2中的Q326與C1簇、C2簇的其他菌株相差1或2個(gè)VNTR位點(diǎn)。WGS新鑒定了2個(gè)簇，共5個(gè)菌株(Q374、Q468、Q531、Q448、Q597)，其簇內(nèi)菌株間相差2個(gè)VNTR位點(diǎn)。這可能與VNTR多變位點(diǎn)的進(jìn)化有關(guān)，同時(shí)也提示不能因?yàn)榫觊g僅相差1～2個(gè)VNTR位點(diǎn)就排除近期傳播[14]?，F(xiàn)有研究多是在VNTR分型一致的菌株中進(jìn)行WGS分型，很少在VNTR不一致的菌株中直接使用WGS分型并評(píng)估其效能，因此沒有全面估計(jì)VNTR分型的靈敏度。

以往研究通過將WGS數(shù)據(jù)與流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果結(jié)合，發(fā)現(xiàn)有流行病學(xué)聯(lián)系的MDR菌株之間最多相差12個(gè)SNP，因此定義菌株間差異小于12個(gè)SNP為近期感染[7,10,15]。但是，本研究中納入的均為XDR菌株，超過一半的菌株同時(shí)對(duì)異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素、二線注射類藥物、氟喹諾酮類藥物、丙硫異煙胺、對(duì)氨基水楊酸8類藥物耐藥，且對(duì)乙硫異煙胺和對(duì)氨基水楊酸這兩種藥物來說，目前已知的耐藥基因僅能解釋不到60%的表型耐藥[16-18]，其具體耐藥機(jī)制及是否有補(bǔ)償突變并不明確，導(dǎo)致在藥物壓力下篩選出的耐藥相關(guān)基因及其補(bǔ)償突變無法被過濾，可能因此造成菌株間SNP差異個(gè)數(shù)較多，即遺傳距離較遠(yuǎn)。采用一個(gè)恒定的差異SNP閾值是適用于所有情況，還是僅限于某些特定情境，還有待進(jìn)一步研究[14]。本研究嘗試將55株菌株進(jìn)行兩兩比對(duì)，構(gòu)建SNP差異個(gè)數(shù)的矩陣，并繪制散點(diǎn)圖(圖3)；但是由于缺乏流行病學(xué)數(shù)據(jù)，無法通過此矩陣定義判斷近期傳播的SNP閾值。

圖3所有菌株間兩兩比較SNP差異個(gè)數(shù)

Fig.3PairwiseSNPdifferencesamong55strains

由于結(jié)核分枝桿菌的遺傳學(xué)特性，其可隨機(jī)發(fā)生自發(fā)突變，且回復(fù)突變極少見。假設(shè)A同時(shí)將其菌株傳給B、C兩人，A菌在B、C兩人體內(nèi)分別進(jìn)化，根據(jù)現(xiàn)有研究，則B與A、C與A的遺傳距離小于12個(gè)SNP；但若直接比較B、C兩菌，其差距最大可能達(dá)24個(gè)SNP。由于本研究中納入的是單中心取樣的菌株，并非疾病預(yù)防控制中心所獲得的某地區(qū)的全部菌株，很有可能存在上述A病例丟失的可能性，造成具有近期傳播關(guān)系的菌株間的遺傳距離較大。因此，本研究中以菌株間差異小于12個(gè)SNP為近期感染這一標(biāo)準(zhǔn)，可能過于嚴(yán)苛。若定義菌株間差異小于24個(gè)SNP為近期感染，則可將55株菌株中的28株(50.91%)分入5 簇。放寬標(biāo)準(zhǔn)后，與W1很接近的菌株Q569、Q573，分別與W1中的菌株最小相差16、23個(gè)SNP；與W2很接近的菌株Q513、Q530，分別與W2中的菌株最小相差17個(gè)SNP；與W4很接近的菌株Q491、Q575、Q405，分別與W4中的菌株最小相差23、15、20個(gè)SNP，且菌株Q405與C4-1中的Q510有一致的VNTR分型。

本研究存在以下不足。2003—2009年診斷為XDR的患者痰標(biāo)本培養(yǎng)物于 -80 ℃ 冰箱中保存至今，時(shí)間久遠(yuǎn)，僅有55株復(fù)蘇成功。本研究納入的是單中心收集的菌株，并非疾病預(yù)防控制中心所獲得的某地區(qū)的全部菌株，且沒有流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，因此缺失較多病例，即缺失傳播的中間環(huán)節(jié)，無法構(gòu)建傳播鏈。成簇菌株采樣時(shí)間跨度較大，最長時(shí)間間隔為42個(gè)月，可能造成簇內(nèi)菌株遺傳距離增加，這一現(xiàn)象在以往大型研究中也有提及[8]。

本研究采用基于SNP的分型方法評(píng)價(jià)VNTR分型在XDR-TB傳播研究中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)VNTR分型具有較高的特異度，但僅用此方法可能會(huì)錯(cuò)誤估計(jì)XDR的傳播性。與VNTR分型相比，WGS可更全面地鑒定出傳播簇?，F(xiàn)有研究認(rèn)為MDR-TB中菌株間相差不超過12個(gè)SNP即有近期傳播關(guān)系，這一臨界值是否適用于XDR-TB有待進(jìn)一步研究。