靳曉東，張聰慧，鐘江

復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)與微生物工程系, 上海 200438

奶牛乳腺炎是奶牛中常見(jiàn)的乳腺炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重影響牛奶的質(zhì)量和產(chǎn)量。其主要致病菌是金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)等[1]。金黃色葡萄球菌是隱性奶牛乳腺炎的主要致病菌[2]。目前，抗生素是治療奶牛乳腺炎的主要手段[3]，但抗生素長(zhǎng)期使用往往引起細(xì)菌耐藥性，導(dǎo)致治療效果不佳[4]，且牛奶因抗生素殘留而被廢棄，嚴(yán)重影響牛奶產(chǎn)業(yè)[5]。

噬菌體用于抗菌治療具有特異性強(qiáng)、成本低等優(yōu)點(diǎn)，且不會(huì)產(chǎn)生耐藥性等不良反應(yīng)，逐漸引起國(guó)內(nèi)外研究者的重視[6]。已有一些研究成功利用金黃色葡萄球菌噬菌體進(jìn)行了奶牛乳腺炎治療[7-8]，為奶牛乳腺炎的噬菌體療法提供了理論基礎(chǔ)。

噬菌體具有宿主特異性，獲得更多種類的噬菌體，建立噬菌體庫(kù)，對(duì)更好地應(yīng)用噬菌體療法具有重要意義。本研究從奶牛場(chǎng)廢水中分離到兩株金黃色葡萄球菌烈性噬菌體，對(duì)其生物學(xué)和基因組學(xué)特征進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25923、1株牛源金黃色葡萄球菌cowSA_1、1株人源金黃色葡萄球菌humanSA_1及1株人源表皮葡萄球菌(S.epidermidis)humanSE_1為本實(shí)驗(yàn)室保藏。細(xì)菌培養(yǎng)采用高鹽LB培養(yǎng)基(酵母提取物5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉70 g/L，pH 7.0，分別添加 0.7% 瓊脂糖和 1.8% 瓊脂獲得半固體和固體高鹽LB培養(yǎng)基)。

1.2 方法

1.2.1噬菌體的分離和純化取自上海市寶山區(qū)某奶牛場(chǎng)，樣品為患病奶牛乳房清洗液，4 ℃ 2 000g離心10 min后取上清液，以ATCC 25923作為指示菌，用雙層瓊脂平板法檢測(cè)是否含有裂解性噬菌體。挑取單個(gè)噬斑，進(jìn)行反復(fù)噬斑純化，直至獲得形態(tài)和大小一致的噬斑。

1.2.2噬菌體的電子顯微鏡觀察采用磷鎢酸負(fù)染法。取15 mL擴(kuò)增純化的噬菌體裂解液，超濾管濃縮為1 mL，取100 μL濃縮液滴于干凈的銅網(wǎng)上，待其沉降10 min，用2%磷鎢酸(pH 6.8)染色10 min，濾紙吸去殘余液體，透射電子顯微鏡(型號(hào)：JEM-2100)觀察噬菌體形態(tài)。

1.2.3噬菌體的熱穩(wěn)定性噬菌體用無(wú)菌SM緩沖液(5.8 g NaCl、2 g MgSO4·7H2O、50 mL 1 mol/L Tris-HCl pH 7.5、5 mL 2%明膠、1 L H2O)稀釋，以合適比例與ATCC 25923菌液混合，分別置于4 ℃、37 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃水浴孵育1 h后，測(cè)定噬菌體的滴度。

1.2.4噬菌體的酸堿穩(wěn)定性噬菌體用SM緩沖液適當(dāng)稀釋后，加至pH為 1.0～10.0 的TM緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl pH 7.2～7.5、10 mmol/L NaCl、10 mmol/L MgCl2、5 mmol/L CaCl2，加濃鹽酸或5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)成不同pH的緩沖液，加H2O定容至100 mL)，以及pH為 11.0、12.0 的NaH2PO4-NaOH緩沖液(50 mL 0.05 mol/L NaH2PO4、26.9 mL 0.1 mol/L NaOH，用5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)成不同pH的緩沖液，加H2O定容至100 mL)中，37 ℃水浴孵育1 h后，測(cè)定噬菌體滴度。

1.2.5噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線經(jīng)測(cè)定，OD600=0.5 時(shí)，菌液密度為 2.26×108CFU/mL，以此計(jì)算噬菌體感染的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)。培養(yǎng)ATCC 25923至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期OD600=0.5，以MOI=0.01 PFU/CFU加入噬菌體液，37 ℃ 孵育10 min，13 000g離心10 min，棄上清液，沉淀重懸于5 mL培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)。每隔10 min取樣，分別測(cè)定噬菌體滴度。

1.2.6噬菌體抑菌能力測(cè)定將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ATCC 25923以MOI為0、0.01、0.1、1 PFU/CFU的比例加入噬菌體液，37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔 30 min 取出100 μL混合液測(cè)OD600值。

1.2.7噬菌體基因組測(cè)序及分析噬菌體基因組抽提采用λ噬菌體DNA快速抽提試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)，按說(shuō)明書操作；全基因組序列分析由美吉生物有限公司利用Illumina PE測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行；全基因組序列功能注釋采用RAST(http://rast.nmpdr.org/)在線軟件[9-11]；用MAGE5構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[12]。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體的分離和電子顯微鏡觀察

以金黃色葡萄球菌ATCC 25923為宿主菌，從奶牛場(chǎng)分離得到兩株金黃色葡萄球菌烈性噬菌體。經(jīng)過(guò)3次純化后，在雙層瓊脂平板上形成清晰、透亮的噬斑，直徑 0.5～1.0 mm，分別命名為phiSA_BS1和phiSA_BS2。噬菌體經(jīng)磷鎢酸負(fù)染后，透射電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，兩株噬菌體均由一個(gè)多面體對(duì)稱的頭部和可伸縮尾部組成(圖1)。phiSA_BS1頭部長(zhǎng)(86.1±3.9) nm，寬(74.7±3.9) nm；尾長(zhǎng)(214.1±16.5) nm，寬(21.9±5.5) nm。phiSA_BS2頭部長(zhǎng)(85.9±5.3) nm，寬(74.0±7.3) nm；尾長(zhǎng)(222.2±8.6) nm，寬(18.2±1.9) nm。從形態(tài)上初步判斷兩株噬菌體均屬于肌尾噬菌體科[13]。

2.2 噬菌體的生物學(xué)性狀

2.2.1一步生長(zhǎng)曲線將噬菌體與金黃色葡萄球菌ATCC 25923以MOI=0.01 混合，振蕩培養(yǎng)，每隔10 min取樣并測(cè)定噬菌體滴度。結(jié)果如圖2A所示，phiSA_BS1的潛伏期約為20 min，裂解期約為20 min，溶菌周期為20～40 min，裂解量約為127 PFU/cell。phiSA_BS2的潛伏期約為20 min，裂解期比phiSA_BS1略長(zhǎng)，約為30 min，溶菌周期為 20～50 min，裂解量約為139 PFU/cell。

2.2.2酸堿穩(wěn)定性將phiSA_BS1、phiSA_BS2適當(dāng)稀釋后加至不同pH的緩沖液中，37 ℃水浴孵育1 h后測(cè)定滴度。結(jié)果如圖2B所示，phiSA_BS1的pH耐受范圍為 5.0～10.0， phiSA_BS2的pH耐受范圍為 3.0～10.0。當(dāng)pH>11或pH<2時(shí)，兩株噬菌體幾乎全部失活。總體來(lái)看，兩株噬菌體具有較寬的酸堿耐受性，phiSA_BS2的耐酸性更強(qiáng)。

2.2.3熱穩(wěn)定性將噬菌體分別在不同溫度下孵育1 h后，測(cè)定滴度。結(jié)果如圖2C所示，50 ℃仍保留相當(dāng)高的滴度，但>60 ℃時(shí)兩株噬菌體幾乎全部失活。

2.2.4抑菌能力將對(duì)數(shù)期ATCC 25923以不同MOI加入噬菌體液，振蕩培養(yǎng)，每隔30～60 min取100 μL混合液測(cè)OD600值。結(jié)果如圖3所示，相比于對(duì)照組，兩株噬菌體均有效抑制了宿主菌的增殖。phiSA_BS1在MOI=1、0.1、0.01 時(shí)能有效抑制宿主菌增殖。phiSA_BS2在MOI=1和 0.1 時(shí)也可有效抑制宿主菌增殖，但所需時(shí)間更長(zhǎng)，裂解效率略低于phiSA_BS1。

A: phiSA_BS1. B: phiSA_BS2.

圖1兩株金黃色葡萄球菌噬菌體的電子顯微鏡觀察

Fig.1ElectronmicroscopyoftwoisolatesofStaphylococcusaureusphages

A: One-step growth curve. B: pH tolerance. C. Temperature tolerance.

圖2兩株噬菌體的生物學(xué)性狀

Fig.2BiologicalpropertiesofphiSA_BS1andphiSA_BS2

A: phiSA_BS1. B: phiSA_BS2.

圖3兩株噬菌體的抑菌能力

Fig.3InhibitionofS.aureusbyphiSA_BS1andphiSA_BS2

2.3 噬菌體的宿主譜分析

取等量phiSA_BS1與phiSA_BS2，分別感染一定數(shù)量的ATCC 25923，牛源和人源金黃色葡萄球菌分離株cowSA_1、humanSA_1，表皮葡萄球菌分離株humanSE_1，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察噬菌斑的數(shù)量及大小。結(jié)果如表1所示， 兩株噬菌體對(duì)3株金黃色葡萄球菌均有裂解作用，但對(duì)表皮葡萄球菌沒(méi)有裂解作用。比較噬菌斑數(shù)量和大小，以ATCC 25923最多，噬菌斑也最大，為 0.5～1 mm；其次為cowSA_1，噬菌斑大小為 0.3～0.5 mm；humanSA_1的噬菌斑最小，為 0.2～0.3 mm。兩株噬菌體對(duì)這3株金黃色葡萄球菌的裂解能力大小為：ATCC 25923>cowSA_1>humanSA_1。

表1兩株噬菌體感染4株葡萄球菌的比較

Tab.1ComparisonoftheinfectionoffourstrainsofStaphylococcusbyphiSA_BS1andphiSA_BS2

PhageATCC 25923cowSA_1humanSA_1humanSE_1phiSA_BS1phiSA_BS2Titer (×108 PFU/mL)10.0±4.8 8.35±0.373.25±0.020Size of plaques++++++-Titer (×108 PFU/mL)2.96±0.054.16±0.151.26±0.060Size of plaques++++++-

+++: large size plaques; ++: median size plaques; +: small size plaques; -: no plaques.

2.4 噬菌體全基因組序列測(cè)定和系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用二代測(cè)序技術(shù)完成兩株噬菌體的測(cè)序?；蚪M核酸序列及注釋結(jié)果已提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(登錄號(hào)MH078572、MH028956)。序列特征如表2所示，兩者基因組大小分別為 142.9 kb和 149.2 kb。與phiSA_BS1相比，phiSA_BS2基因組全長(zhǎng)多出7 kb左右，GC含量略低于前者，多出9個(gè)開放讀碼框(open reading frame，ORF)。

將phiSA_BS1、phiSA_BS2的全基因組核酸序列及主要尾部蛋白(major tail protein)、噬菌體裂解酶(endolysin)等蛋白序列與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，應(yīng)用MEGA軟件進(jìn)行進(jìn)化樹分析，結(jié)果如圖4～6所示。

表2兩株噬菌體的基因組特征

Tab.2GenomiccharacteristicsofphiSA_BS1andphiSA_BS2

GenomephiSA_BS1phiSA_BS2Type of nucleic acidLinear, double- stranded DNALinear, double- stranded DNALength142 978 bp149 230 bpGC content29.80%29.61%Predicted ORFs201210 Structure and proteins84 Porin11 Lysin12 Hypothetic proteins164169 DNA replication and modification 2420 Transcription regulation21 tRNA01 Other112

圖4噬菌體全基因組核酸序列進(jìn)化樹分析

Fig.4Phylogenicanalysisoffullgenomeofphages

圖5噬菌體主要尾部蛋白的進(jìn)化樹分析

Fig.5Phylogenicanalysisofmajortailproteinsofphages

圖6噬菌體裂解酶進(jìn)化樹分析

Fig.6Phylogenicanalysisoflysinsofphages

全基因組分析結(jié)果表明，phiSA_BS1與phiSA_BS2的同源性高達(dá)99%，但兩者與已報(bào)道的金黃色葡萄球菌噬菌體親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖4)，判斷兩株噬菌體構(gòu)成金黃色葡萄球菌噬菌體的新進(jìn)化分支。對(duì)主要尾部蛋白的分析也證實(shí)了這一點(diǎn)(圖5)。

3 討論

本研究分離到兩株金黃色葡萄球菌裂解性噬菌體phiSA_BS1和phiSA_BS2，并對(duì)形態(tài)、復(fù)制特征、熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性及其對(duì)不同葡萄球菌分離株的裂解性進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，這兩株噬菌體能耐受50 ℃處理，pH耐受范圍也較寬?？紤]到生物安全性，對(duì)這兩株噬菌體在乳酸菌、腸桿菌、腸球菌中進(jìn)行了裂解實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均為陰性(數(shù)據(jù)未在本文顯示)。

對(duì)兩株噬菌體進(jìn)行全基因組測(cè)序，結(jié)果表明，兩株噬菌體的親緣關(guān)系非常接近，同源性高達(dá)99%，但均與已知的金黃色葡萄球菌噬菌體親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。與最近緣的噬菌體676Z進(jìn)行NCBI blastn全基因組比較，發(fā)現(xiàn)phiSA_BS1與其覆蓋度(query cover)為42%，相似度(ident)為75%；phiSA_BS2與其覆蓋度為41%，相似度為75%。由此可判斷兩株噬菌體均為全新的金黃色葡萄球菌噬菌體進(jìn)化分支。對(duì)噬菌體功能基因的系統(tǒng)發(fā)育分析也證實(shí)了這一點(diǎn)。

噬菌體裂解酶因具有直接的殺菌作用而受到關(guān)注。將兩株噬菌體的裂解酶氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，同源性較高的序列均為金黃色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌(S.sciuri)、小牛葡萄球菌(S.vitulinus)等中含CHAP結(jié)構(gòu)域的蛋白(CHAP domain-containing protein)，與其他噬菌體的裂解酶顯著不同，具有一定的研究?jī)r(jià)值。

奶牛乳腺炎是乳業(yè)的重要挑戰(zhàn)之一。一方面細(xì)菌耐藥性的日益增長(zhǎng)使其治療越來(lái)越困難，另一方面即使可用抗生素進(jìn)行治療，但用藥后相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)的牛奶會(huì)因?yàn)榭股匚廴径粡U棄。因此，研發(fā)替代抗生素的療法很有意義，噬菌體療法就是潛在的替代療法之一。體外實(shí)驗(yàn)中，已有相關(guān)研究證實(shí)金黃色葡萄球菌噬菌體可有效抑制宿主菌增殖[14-16]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，奶牛乳腺炎的噬菌體療法也取得了一定進(jìn)展。例如，孫利利等[8]將噬菌體通過(guò)乳頭管灌注患病乳室，對(duì)急性乳腺炎奶牛進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)噬菌體具有明顯療效。近年來(lái)，對(duì)致病性金黃色葡萄球菌噬菌體的分離越來(lái)越多，生物學(xué)性狀也獲得了鑒定。隨著高通量測(cè)序的發(fā)展，噬菌體全基因組序列特征得到了解析，完善了噬菌體庫(kù)，為奶牛乳腺炎的噬菌體療法提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[17-21]。本研究從奶牛場(chǎng)分離到的兩株噬菌體均為裂解性噬菌體，生物學(xué)性狀穩(wěn)定，在奶牛乳腺炎的治療中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。