高娟，魏琦，邵輝川，吳輝

1. 合肥金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司,合肥 230088； 2. 淮北朝陽醫(yī)院,淮北 235000

潘多拉菌(Pandoraea)是2000年Coenye等發(fā)現(xiàn)并命名的一個新菌屬，目前有10個菌種(其中Pandoraeagenomospecies包含3個未正式命名的基因種)，很難通過傳統(tǒng)生物化學(xué)方法鑒別[1]。此菌的表型類似于洋蔥伯克霍爾德菌、皮克特羅爾斯頓菌或少見嗜銅菌，常導(dǎo)致鑒定錯誤。分子生物學(xué)技術(shù)是鑒定此類細(xì)菌的最有效方法[2]。國內(nèi)對此菌鮮有報道。本實(shí)驗(yàn)室從新生兒血培養(yǎng)中檢出1株潘多拉菌，通過分子生物學(xué)基因測序后，再采用常規(guī)方法重新評估，詳情報道如下。

1 臨床材料

1.1 病例

患者，男性，年齡23 d，因“全身皮膚黏膜黃染18 d”入院。入院時主要癥狀及體征如下：呼吸平穩(wěn)，體溫正常，全身皮膚黏膜黃染，以頭面部、四肢、軀干為著，兩肺呼吸音清，未聞及干濕啰音，精神反應(yīng)欠佳。入院診斷為“新生兒黃疸：高膽紅素血癥？新生兒敗血癥？”主要實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果如下：經(jīng)皮膽紅素測定(2016年5月18日門診)示 215 μmol/L；梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)(Treponemapallidumparticle agglutination assay，TPPA)陽性；梅毒甲苯胺紅不加熱血清反應(yīng)素試驗(yàn)(toluidine red untreated serum test，TRUST)示1∶2；血常規(guī)示白細(xì)胞 6.59×109/L↓，中性粒細(xì)胞絕對值 1.21×109/L↓，淋巴細(xì)胞 3.85×109/L↑，中性粒細(xì)胞 18.40%↓，淋巴細(xì)胞 58.40%↑，嗜酸性粒細(xì)胞 8.60%↑；血清學(xué)指標(biāo)超敏C反應(yīng)蛋白、C反應(yīng)蛋白均正常；肝功能示總膽紅素 212.5 μmol/L↑，直接膽紅素 18.2 μmol/L↑，總膽汁酸 14.00 μmol/L↑，總蛋白 51.8 g/L↓，白蛋白 36.9 g/L↓，白球比 2.5↓，前白蛋白128 mg/L↓，谷氨酰轉(zhuǎn)移酶155 U/L↑；大小便常規(guī)示正常。細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果如下：2016年5月19日行血培養(yǎng)(梅里埃兒童瓶，單次) 15.12 h報陽，涂片顯示為革蘭陰性桿菌，培養(yǎng)及多次VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀鑒定為尿道寡源桿菌，測序?yàn)榕硕嗬鷮?。給予患者青霉素鈉20萬U、頭孢哌酮/舒巴坦 0.2 g治療；10 d后根據(jù)細(xì)菌學(xué)結(jié)果，停用青霉素，使用氨芐西林鈉 0.2 g，并繼續(xù)使用頭孢哌酮/舒巴坦。1周后出院時，患兒全身皮膚黏膜無黃染，生命體征平穩(wěn)，病情治愈，門診隨訪。

1.2 儀器和方法

1.2.1儀器BacT/ALERT 3D全自動血培養(yǎng)儀、VITEK 2 Compac全自動微生物鑒定及藥敏分析儀和配套GN鑒定卡為法國梅里埃生物公司產(chǎn)品，KB法藥敏紙片購自英國Oxoid公司，S1000TMThermal Cycler PCR儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品，哥倫比亞血平板及巧克力平板購自鄭州安圖生物工程股份有限公司，快速革蘭染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.2.2方法培養(yǎng)及染色：采集患兒2～5 mL外周血注入梅里埃兒童血培養(yǎng)瓶中，置于BacT/ALERT 3D全自動血培養(yǎng)儀進(jìn)行培養(yǎng)，報陽后轉(zhuǎn)種于哥倫比亞血平板及巧克力平板，35 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，對生長菌落進(jìn)行快速革蘭染色。生化鑒定及藥敏試驗(yàn)：采用VITEK 2 Compac全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)對菌株進(jìn)行鑒定，選用GN鑒定卡，KB藥敏法，具體操作按說明書進(jìn)行。16S rRNA基因測序鑒定：rRNA基因序列的擴(kuò)增及測序采用PrepManTMUltra樣品制備液，按操作說明書提取細(xì)菌總DNA。16S rRNA基因擴(kuò)增采用廣譜引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)與1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，使用 Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(TaKaRa)及2×Taq PCR MasterMix進(jìn)行核酸提取并擴(kuò)增。為保證PCR的準(zhǔn)確性，分別以無菌去離子水、大腸埃希菌ATCC 25922作為陰性對照。擴(kuò)增產(chǎn)物送廣州艾基生物技術(shù)有限公司測序。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)和染色特性

潘多拉菌為需氧菌，在哥倫比亞血平板及巧克力瓊脂平板上35 ℃能生長，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，形成圓形、凸起、邊緣整齊、表面光滑、直徑 0.5～1 mm大小的菌落(圖1)。革蘭染色為陰性桿菌，無芽胞，呈寬 0.55～0.7 μm、長 4.0～15 μm的直桿菌，常單個出現(xiàn)。在心浸液瓊脂上35 ℃培養(yǎng)18～24 h，可形成短至中等長度的直桿菌。其革蘭染色形態(tài)見圖2。

圖1哥倫比亞血平板、巧克力瓊脂平板培養(yǎng)72h

Fig.1CultureonColumbiabloodplateandchocolateagarplatefor72h

圖2顯微鏡下形態(tài)(革蘭染色)

Fig.2Microscopicmorphology(Gramstaining)

2.2 生化鑒定和藥敏分析

氧化酶、觸酶陽性，生化反應(yīng)不活躍，不發(fā)酵也不氧化糖類。硝酸鹽還原、亞硝酸鹽還原、尿素、鳥氨酸、賴氨酸、精氨酸、尿素酶陰性，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、L-脯氨酸芳胺酶、酪氨酸芳胺酶、檸檬酸鹽(鈉)、乳酸鹽產(chǎn)堿、琥珀酸鹽產(chǎn)堿、氨基乙酸芳胺酶、組氨酸同化、L-蘋果酸鹽同化、ELLAN、L-乳酸鹽同化陽性。

2.3 16S rRNA基因測序鑒定

進(jìn)行靶向DNA測序，16S rRNA基因擴(kuò)增可見單一清晰目的條帶，與食草酸潘多拉菌(Pandoraeaoxalativorans)序列相似度最高，為100%，但未高于第二相似度菌株痰潘多拉菌(Pandoraeasputorum)0.8%，因此只能鑒定到潘多拉菌屬(圖3)。

表1抗生素敏感試驗(yàn)

Tab.1Antibioticsusceptibilitytesting

抗生素敏感性頭孢他啶耐藥阿米卡星耐藥氨曲南耐藥慶大霉素耐藥妥布霉素耐藥哌拉西林耐藥頭孢吡肟耐藥環(huán)丙沙星耐藥左氧氟沙星耐藥美羅培南耐藥替卡西林耐藥亞胺培南敏感四環(huán)素敏感復(fù)方磺胺甲唑敏感氨芐西林/舒巴坦敏感哌拉西林/他唑巴坦中介

圖3基因測序

Fig.3Genesequencing

3 討論

潘多拉菌可分離自敗血癥和呼吸道感染(主要是囊性纖維化)患者，也可分離自非囊性纖維化患者的血培養(yǎng)和環(huán)境樣本[3]，其致病性尚未完全闡明。本研究中的菌株分離自疑似新生兒敗血癥患兒，與文獻(xiàn)[4]中表述相似。

新生兒敗血癥是新生兒時期較常見的重癥疾病，缺乏典型臨床特征，尤其是體征、癥狀不明顯，有多種表現(xiàn)形式。黃疸可能為唯一或突出表現(xiàn)，表現(xiàn)為黃疸突然加重或消退后反復(fù)出現(xiàn)，或一直不退。本例患兒出生5 d后開始黃疸，23 d黃疸加重，臨床表現(xiàn)為黃疸，精神、食欲一般，睡眠一般。此患兒總蛋白51.8 g/L，白蛋白36.9 g/L，白球比2.5，前白蛋白128 mg/L，均偏低，且合并梅毒螺旋體感染(TPPA陽性，TRUST 1∶2)，母孕期有上呼吸道感染及梅毒病史、行青霉素治療史。患兒免疫力低下，機(jī)體抵抗能力下降，白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞未升高反而下降，淋巴細(xì)胞升高，C反應(yīng)蛋白正常，單次血培養(yǎng)陽性。雖然臨床表現(xiàn)符合報道中黃疸可能為敗血癥唯一表現(xiàn)，但不能確定為新生兒敗血癥。

根據(jù)新生兒敗血癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，具有臨床表現(xiàn)并符合下列任一項(xiàng)：①血培養(yǎng)培養(yǎng)出致病菌；②培養(yǎng)出條件致病菌，則需與另次(份)血培養(yǎng)出同種細(xì)菌，才能確定診斷為新生兒敗血癥。或具有臨床表現(xiàn)且具備以下任一項(xiàng)：①非特異性檢查如白細(xì)胞計數(shù)、白細(xì)胞分類、C反應(yīng)蛋白、前降鈣素、白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)、血小板計數(shù)、微量法紅細(xì)胞沉降率中，非特異性檢查異?！?項(xiàng)；②血標(biāo)本病原菌抗原或DNA檢測陽性才能臨床診斷新生兒敗血癥?？紤]到本實(shí)驗(yàn)室第1次分離到該菌，且后續(xù)也未分離到該菌，如果是污染，則該菌臨床污染可能性大，污染源可能是醫(yī)護(hù)人員、患者體表等。由于該菌致病性至今尚未完全闡明，臨床無法判斷是否為致病菌排除污染可能，所以臨床懷疑新生兒敗血癥時，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建議臨床血培養(yǎng)至少同時采集2套血標(biāo)本[2個不同采集部位和(或)不同采集時間]，同時進(jìn)行其他非特異性檢查，結(jié)合臨床表現(xiàn)，才能提高新生兒敗血癥的診斷率。

到目前為止，潘多拉菌的致病因子、致病機(jī)制及不同患者間的傳播概率均不清楚，需更多的臨床病例數(shù)據(jù)。臨床常規(guī)微生物學(xué)方法對潘多拉菌屬鑒定或種間鑒別較困難。本實(shí)驗(yàn)室采用VITEK2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)鑒定該菌為尿道寡源菌，鑒定率為94%。查閱尿道寡源菌相關(guān)文獻(xiàn)，尿道寡源菌苯丙氨酸脫氨酶陽性[6]，而本菌苯丙氨酸脫氨酶陰性，與其不一致，遂進(jìn)行靶向DNA測序，測序結(jié)果為潘多拉菌屬。此菌國內(nèi)報道較少，主要是其易被鑒定為洋蔥伯克霍爾德菌、皮克特羅爾斯頓菌或少見嗜銅菌[7-8]，對可疑潘多拉菌應(yīng)進(jìn)一步利用分子生物學(xué)檢測方法進(jìn)行鑒定[9]。首先應(yīng)用屬特異性引物panF-panR鑒定為潘多拉菌屬，然后利用種特異性引物[spuF-spuR(痰潘多拉菌、norF-norR(紐倫堡潘多拉菌)、pnoF-pnoR(呼吸潘多拉菌)、appuF-panR(背叛潘多拉菌、肺潘多拉菌)]進(jìn)行潘多拉菌屬間的鑒定[9]。結(jié)果表明，所有檢測的靈敏度>97%，特異度>98%(呼吸潘多拉菌為82%)，但不能對背叛潘多拉菌與肺潘多拉菌進(jìn)行鑒別。該菌16S rRNA序列與食草酸潘多拉菌相似度為100%，但未高于第二相似度痰潘多拉菌 0.8%，僅能報告潘多拉菌屬。

綜上所述，目前常規(guī)臨床微生物學(xué)方法很難將潘多拉菌正確鑒定到屬或種的水平，分子生物學(xué)技術(shù)是最有效的手段[13]。臨床分離到尿道寡源菌、洋蔥伯克霍爾德菌、皮克特羅爾斯頓菌或少見嗜銅菌，如果懷疑潘多拉菌，建議進(jìn)行分子生物學(xué)檢測。該菌對多類抗生素耐藥，臨床需謹(jǐn)慎用藥[14]。