王金彩，王淑雨，劉小紅，路平，李小瑞

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1藥學(xué)部，3腫瘤科，河南新鄉(xiāng)453100

2鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥理系，鄭州450001

肝癌的病死率位居全部惡性腫瘤的第2位[1]，嚴(yán)重危害人類的生命健康。目前，肝癌的主要治療手段包括手術(shù)治療和放化療，雖然取得一定效果，但仍然不滿足要求，尋找安全有效的治療方法是研究的熱點(diǎn)。水飛薊賓于水飛薊果實(shí)中提取，屬于黃酮木質(zhì)類化合物，可保護(hù)肝細(xì)胞，且對(duì)肝組織炎癥和其他損傷具有治療作用[2]。研究表明，水飛薊賓具有抗癌作用，對(duì)卵巢癌、宮頸癌、皮膚癌、舌鱗癌均有抑制作用[3-6]。本研究探討水飛薊賓對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響，以期為肝癌的治療提供新思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

人肝癌細(xì)胞HepG2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。試劑：青霉素、鏈霉素均購(gòu)自上海紫一試劑廠，水飛薊賓、胰蛋白酶、RPMI1640培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）單克隆抗體、磷酸化的STAT3（p-STAT3）單克隆抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotease-9，MMP-9）單克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Stanta公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞蛋白提取試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。儀器：HBS-1096A酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購(gòu)自南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，TS100倒置顯微鏡購(gòu)自日本尼康公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)取出保存于液氮罐中的肝癌細(xì)胞HepG2，37℃融化60 s，以5 ml的細(xì)胞培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基）重懸細(xì)胞，離心半徑為8 cm，1000 r/min離心10 min，吸除上清液，加入5 ml的細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)到90%左右時(shí)，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，以0.25%的胰蛋白酶37℃消化2 min，轉(zhuǎn)移至離心管中，離心半徑為8 cm，1000 r/min離心10 min，加入適量的細(xì)胞培養(yǎng)液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求將細(xì)胞按照不同比例接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 噻唑藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為6×104/ml，以每孔100 μl的細(xì)胞懸浮液接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)過(guò)夜后，分別將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為含有0、50、100、200和400 μmol/L的水飛薊賓細(xì)胞培養(yǎng)液，設(shè)置空白組，空白組中不加細(xì)胞，每個(gè)濃度梯度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。將上述細(xì)胞于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，加入5 mg/ml的噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）溶液，20 μl/孔，37 ℃反應(yīng) 4 h，吸除上清液后，加入150 μl的二甲基亞砜溶液孵育10 min。觀察結(jié)晶物完全溶解后，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)490 nm處每孔的吸光度值（A值），以0 μmol/L的水飛薊賓作用組為對(duì)照，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（水飛薊賓作用組A值－空白組A值）（/0 μmol/L水飛薊賓作用組A值－空白組A值）×100%。

1.2.3 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力于Transwell小室中每孔加入50 μl的基質(zhì)膠，37℃濕化2 h。取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞，分別用含0、200 μmol/L的水飛薊賓細(xì)胞培養(yǎng)液（不含10%胎牛血清）重懸細(xì)胞，使每毫升細(xì)胞懸浮液中含有1×105個(gè)細(xì)胞。在Transwell小室的上室加入400 μl的細(xì)胞懸浮液，下室加入600 μmol/L的含有10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用棉簽擦掉沒(méi)有穿膜的細(xì)胞，無(wú)水乙醇固定20 min后，蘇木素染色。顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察侵襲細(xì)胞數(shù)目。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)細(xì)胞中STAT 3、p-STAT 3和MMP- 9蛋白的表達(dá)水平肝癌細(xì)胞經(jīng)0、200 μmol/L的水飛薊賓作用48 h后，按照蛋白提取試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)提取的蛋白濃度。取蛋白樣品加入等體積的2×Loading buffer混合后，100℃煮沸5 min至蛋白變性，加入至聚丙烯酰胺凝膠電泳（10%分離膠，5%濃縮膠）上樣孔中，每孔加入50 μl的變性蛋白樣品進(jìn)行電泳，初始電壓80 V，觀察溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)整為120 V至溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠底端，電泳結(jié)束。4℃、90 V將蛋白轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為90 min，用5%脫脂奶粉37℃封閉90 min。加入一抗（500倍稀釋，4℃孵育過(guò)夜）、二抗（2000倍稀釋，37℃孵育60 min），滴加顯色液，以GAPDH為內(nèi)參，分析STAT3、p-STAT3、MMP-9蛋白的表達(dá)水平。

1.2.5 STAT 3信號(hào)通路激活劑SD19對(duì)肝癌細(xì)胞存活率、侵襲細(xì)胞數(shù)目和STAT 3、p-STAT 3、MMP- 9蛋白表達(dá)的影響根據(jù)處理方法不同，將肝癌細(xì)胞分為未處理組、藥物作用組和激活劑組，其中未處理組不加入任何藥物，藥物作用組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入200 μmol/L的水飛薊賓，激活劑組在藥物作用組的基礎(chǔ)上再加入8 μmol/L的STAT3信號(hào)通路激活劑SD19。將3組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率，Transwell小室檢測(cè)侵襲細(xì)胞數(shù)目，Western blot檢測(cè)細(xì)胞中 STAT3、p-STAT3、MMP-9蛋白的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞存活率的比較

分別采用0、50、100、200和400 μmol/L的水飛薊賓處理后的肝癌細(xì)胞，細(xì)胞存活率隨水飛薊賓濃度升高而逐漸下降，半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為（198.64 ± 25.61）μmol/L。（圖1）

圖1 不同濃度水飛薊賓作用于肝癌細(xì)胞后的細(xì)胞存活率

2.2 侵襲細(xì)胞數(shù)目比較

200 μmol/L的水飛薊賓作用于肝癌細(xì)胞后侵襲細(xì)胞數(shù)目為（96.35±13.24），明顯少于0 μmol/L的水飛薊賓作用后的（192.58±13.64），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=16.94，P＜0.01）。

2.3 STAT 3、p-STAT 3和MMP- 9蛋白表達(dá)水平的比較

Western blot結(jié)果顯示，與 0 μmol/L 的水飛薊賓作用的肝癌細(xì)胞相比，200 μmol/L的水飛薊賓作用于肝癌細(xì)胞后，p-STAT3和MMP-9蛋白表達(dá)水平均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而0 μmol/L與200 μmol/L的水飛薊賓作用的肝癌細(xì)胞STAT3蛋白表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（圖2、表1）

2.4 3組細(xì)胞存活率、侵襲細(xì)胞數(shù)目、STAT 3、p-STAT 3和MMP- 9蛋白表達(dá)水平的比較

圖2 Western blot檢測(cè)肝癌細(xì)胞中STAT 3、p-STAT 3和MMP- 9蛋白的表達(dá)情況

表1 不同濃度水飛薊賓處理后肝癌細(xì)胞中STAT 3、p-STAT 3和MMP- 9蛋白表達(dá)情況的比較（± s）

表1 不同濃度水飛薊賓處理后肝癌細(xì)胞中STAT 3、p-STAT 3和MMP- 9蛋白表達(dá)情況的比較（± s）

水飛薊賓濃度0 μ m o l/L 2 0 0 μ m o l/L t值P值3.2 5±0.2 4 0.6 8±0.0 6 1 7.9 9 0.0 0 0.9 6±0.1 1 0.3 6±0.0 4 8.8 8 0.0 0 1.3 6±0.2 3 1.4 5±0.1 7 0.5 4 0.6 1 M M P-9 p-S T A T 3 S T A T 3

3組細(xì)胞存活率、侵襲細(xì)胞數(shù)目、p-STAT3和MMP-9蛋白表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。藥物作用組和激活劑組的細(xì)胞存活率、侵襲細(xì)胞數(shù)目、p-STAT3和MMP-9蛋白表達(dá)水平均明顯低于未處理組，且激活劑組的細(xì)胞存活率、侵襲細(xì)胞數(shù)目、p-STAT3和MMP-9蛋白表達(dá)水平均明顯高于藥物作用組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但3組肝癌細(xì)胞中STAT3蛋白表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（圖3、表2）

圖3 Western blot檢測(cè) 3組細(xì)胞中STAT 3、p-STAT 3和MMP- 9蛋白的表達(dá)情況

表2 3組細(xì)胞存活率、侵襲細(xì)胞數(shù)目、STAT 3、p-STAT 3和MMP- 9蛋白表達(dá)水平的比較（± s）

表2 3組細(xì)胞存活率、侵襲細(xì)胞數(shù)目、STAT 3、p-STAT 3和MMP- 9蛋白表達(dá)水平的比較（± s）

注：a與未處理組比較，P＜0.01；b與藥物作用組比較，P＜0.01

指標(biāo)細(xì)胞存活率（%）侵襲細(xì)胞數(shù)目S T A T 3 p-S T A T 3 M M P-9 1 0 0.0 5±1 1.2 8 1 9 8.5 4±2 0.6 6 1.1 2±0.1 3 0.8 6±0.0 9 1.1 4±0.0 8 5 6.8 4±6.9 2 a 7 9.6 9±8.2 1 a 1.1 0±0.1 4 0.2 9±0.0 3 a 0.1 5±0.0 3 a 8 0.6 7±4.9 7 ab 1 2 8.6 7±1 6.8 3 ab 1.1 3±0.1 2 0.4 5±0.0 4 ab 0.6 7±0.0 9 ab未處理組藥物作用組激活劑組

3 討論

水飛薊賓是一種黃酮類的化合物，由1分子的松柏醇和1分子的紫杉葉素構(gòu)成[7]。水飛薊賓具有抗自由基、降血壓、抑制氧合酶、抑制肝纖維化、降血脂和增加心肌細(xì)胞抵抗力等多種作用[8-9]。研究表明，水飛薊賓可抑制人黑色素瘤細(xì)胞A375-S2[10]、肝癌細(xì)胞[11]、乳腺癌細(xì)胞SKBR3[12]、前列腺癌細(xì)胞PC-33[13]、卵巢癌細(xì)胞A2780[14]等多種細(xì)胞的增殖。本研究分別以0、50、100、200和400 μmol/L的水飛薊賓作用于肝癌細(xì)胞48 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨水飛薊賓作用濃度的升高，細(xì)胞存活率呈下降趨勢(shì)。表明水飛薊賓可抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力，且呈濃度依賴性，與之前的報(bào)道一致[10-14]，均說(shuō)明其具有抗腫瘤作用。

腫瘤細(xì)胞的侵襲是腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的前提條件。目前，研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶家族與腫瘤侵襲能力相關(guān)，因需要金屬離子如鈣、鋅等的輔助才能夠發(fā)揮作用而得名，具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用[15]。MMP-9由9個(gè)內(nèi)含子和13個(gè)外顯子組成，可維持細(xì)胞外基質(zhì)平衡，其多種作用底物能夠作用于Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ和Ⅺ膠原蛋白[16]。研究表明，MMP-9在腫瘤組織中的表達(dá)異常升高，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲[17]。本研究中以0 μmol/L、200 μmol/L的水飛薊賓作用于肝癌細(xì)胞，Transwell小室檢測(cè)侵襲細(xì)胞數(shù)目，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，200 μmol/L水飛薊賓作用后的侵襲細(xì)胞數(shù)目和MMP-9表達(dá)水平均明顯降低，表明水飛薊賓可能通過(guò)抑制MMP-9的表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的侵襲。

STAT3是一個(gè)關(guān)鍵的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，磷酸化后可形成二聚體進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[18]。STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與腫瘤發(fā)生有關(guān)，能夠通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲過(guò)程，影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。腫瘤組織中，STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常激活可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，而腫瘤組織中的p-STAT3蛋白表達(dá)升高，可抑制STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[19]。研究表明，肝癌組織中p-STAT3水平升高，其惡性程度隨STAT3表達(dá)水平的降低而降低，抑制STAT3表達(dá)后，肝癌小鼠模型的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制[20-22]。本研究首先檢測(cè)了200 μmol/L的水飛薊賓作用后的肝癌細(xì)胞中STAT3信號(hào)通路的活化水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，200 μmol/L的水飛薊賓作用后，肝癌細(xì)胞中p-STAT3的表達(dá)水平降低。進(jìn)一步用8 μmol/L的SD19和200 μmol/L的水飛薊賓共同作用于肝癌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8 μmol/L的SD19和200 μmol/L的水飛薊賓共同作用的激活劑組的細(xì)胞存活率、侵襲細(xì)胞數(shù)目、p-STAT3和MMP-9蛋白表達(dá)水平均明顯高于單純水飛薊賓藥物作用組（P＜0.01）。表明STAT3信號(hào)通路激活劑能夠部分逆轉(zhuǎn)水飛薊賓對(duì)肝癌細(xì)胞的抑生長(zhǎng)和抑侵襲作用。本研究尚存在一定的不足之處，本研究?jī)H于體外進(jìn)行了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，后續(xù)將進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)的臨床研究。

綜上所述，水飛薊賓能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲，作用機(jī)制可能與抑制STAT3信號(hào)通路有關(guān)。