程志豪 頓耀艷 劉 潔 李玉婷 郭煜暉 何毓敏 袁 丁 張長(zhǎng)城

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002)

Effectsofagingoncolonstemcellsandmicroenvironmentinrat

CHENGZhi-Hao,DUNYao-Yan,LIUJie,etal.

MedicalCollegeofThreeGorgesUniversity,Yichang443002,Hubei,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the changes of rat colon stem cells and their microenvironment of Wnt/β-catenin signaling pathway during the aging process.MethodsMale SD rats at different developmental stages were divided into adult group(6 months)and aging group(24 months), 10 rats in each group.Routine periodate and Schiff reagent (PAS) staining, alcianblue staining, immunohistochemistry and RT-PCR were used to detect changes in adult group and aging group colon stem cell proliferation and differentiation and Wnt/β-catenin signaling pathway.ResultsCompared with those of adult group, the number of goblet cells in aging group were decreased(P<0.01), mRNA expressions of stem cell markers Lgr5, Bmi-1, MUC1,MUC2 were reduced(P<0.01), the expression of PCNA was increased(P<0.01), the microenvironment Wnt/β-catenin signaling pathway related proteinβ-catenin expression was increased(P<0.05), the expression of GSK-3β was decreased(P<0.01).ConclusionsDuring the rat aging process, the number of colon stem cells and the globet cell differentiation of intestinal stem cells are reduced, the proliferation of colon stem cells are increased , Wnt/β-catenin signal pathway is up-regulated.

【Keywords】 Aging; Colon stem cells; Wnt/β-catenin signal pathway

研究顯示，機(jī)體的衰老始于腸道衰老〔1〕。腸道主要功能是吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及作為一個(gè)屏障阻擋細(xì)菌、病毒等有害物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體。衰老過(guò)程中，腸道免疫系統(tǒng)受到損害、炎癥反應(yīng)也增加，老年人經(jīng)常出現(xiàn)慢性便秘、排便障礙和尿失禁等癥狀及對(duì)腸道感染的易感性增加〔2〕。腸黏膜在機(jī)體中更新頻率最高，而腸黏膜不斷更新依賴于腸道干細(xì)胞的增殖、分化。結(jié)腸上皮的單層柱狀上皮內(nèi)陷并被固有層包圍形成隱窩，每個(gè)隱窩由其中的腸干細(xì)胞維持〔3〕。結(jié)腸組織中存在多種類(lèi)型的干細(xì)胞，在維持結(jié)腸正常生理功能和促進(jìn)黏膜炎癥傷口愈合中有重要作用〔4〕。

腸道干細(xì)胞主要分為兩種：Lgr5(G-protein-coupled receptor-5)標(biāo)記的窩基底柱狀細(xì)胞(CBC)為活化的干細(xì)胞；而另一種Bmi-1(Bmilpolycombringfinger oncogene 1)特異性標(biāo)記的DNA 標(biāo)記滯留細(xì)胞(LRC)處于靜止?fàn)顟B(tài)〔5，6〕。大量研究表明，腸道干細(xì)胞受其所處的微環(huán)境中Wnt/β-catenin通路調(diào)控〔7〕。有研究表明，衰老伴隨干細(xì)胞增殖分化功能的改變及干細(xì)胞的衰退〔8〕。本課題組前期研究顯示，衰老大鼠小腸干細(xì)胞數(shù)量減少，干細(xì)胞微環(huán)境Wnt/β-catenin信號(hào)下調(diào)〔9〕。但衰老過(guò)程中大鼠結(jié)腸干細(xì)胞的增殖分化功能及其微環(huán)境是否發(fā)生變化尚不明確。本研究旨在探討衰老過(guò)程中大鼠結(jié)腸干細(xì)胞增殖分化功能及其微環(huán)境中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的變化。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)6月齡、24月齡雄性SD大鼠各10只，購(gòu)自三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂) 2011-0061。

1.2主要試劑 RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，日本TaKaRa公司；Lgr5、Bmi-1、MUC1、MUC2、β-actin 引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列：Lgr5上游(5′→3′)CCTGGGAAAGCAAACCCG，下游(5′→3′)CGGAATCGGAAGGCAAGTC；Bmi-1上游(5′→3′)ACTCTGGGAGCGACAAGGC，下游(5′→3′)GATGATTTCCGAGGTCTACTGGC；MUC1上游(5′→3′)CACTCACGGACGCTATGTGC，下游(5′→3′)GGTTGGTGTAAGAGAGACCGCTAC；MUC2上游(5′→3′)CACGACACCAGGACCTTTCC，下游(5′→3′)TGCTTGGGAGGCACGAAG；β-actin上游(5′→3′)TGACCGAGCGTGGCTACAG，下游(5′→3′)CAGGGAGGAAGAGGATGCG。一抗β-catenin、GSK-3β，美國(guó) Santa Cruz公司。

1.3主要儀器 攤片烤片機(jī)(CS-V1)，宏業(yè)醫(yī)用(湖北孝感)儀器有限公司；超薄切片機(jī)(ULTR ACUTR)，Leica 公司(德國(guó))；光學(xué)倒置顯微鏡(CX41)，日本Olympus公司；1-15K離心機(jī)，德國(guó) Sigma公司；JB-3恒溫磁力攪拌器，常州澳華司樂(lè)儀器(AHYQ)有限公司。

1.4方法

1.4.1動(dòng)物分組及樣品處理 大鼠分為成年組(6月齡大鼠)、老年組(24月齡大鼠)各10只。自由飲水，禁食24 h。麻醉后取血打開(kāi)腹腔，取近端結(jié)腸段1～2 cm，放入包埋盒并立即投入4%多聚甲醛中，4℃固定24 h后更換75%酒精，常規(guī)脫水，石蠟包埋。

1.4.2HE染色、高碘酸-雪夫試劑(PAS)染色和阿利新藍(lán)染色 石蠟連續(xù)切片，每張厚4 μm，每隔5張取1張，依次在冷水、熱水中攤開(kāi)后黏附于載玻片上，60℃烤4 h。切片機(jī)連續(xù)切片(4 μm)，經(jīng)過(guò)冷水、45℃熱水?dāng)偲箴じ接谳d玻片上，60℃烤4 h。阿利新藍(lán)染色：常規(guī)脫蠟后，先蒸餾水沖洗，然后甩干液體立即滴加阿利新藍(lán)染液，孵育5 min，蒸餾水沖洗干凈，甩干后每個(gè)組織上滴加一滴核固紅染液室溫孵育2 min，流水沖洗后吹干封片。PAS染色：常規(guī)脫蠟后，用蒸餾水沖洗，甩干每張玻片上的蒸餾水，滴加高碘酸染液孵育10 min，流水沖洗后，甩干組織上的水分，滴加一滴雪夫試劑避光孵育10 min，流水沖洗，滴加蘇木素染液1 min，流水沖洗，吹干封片。顯微鏡取圖，每組隨機(jī)取5只大鼠，每只大鼠結(jié)腸各取3張不連續(xù)切片。阿利新藍(lán)、PAS染色計(jì)數(shù)不同組別每只大鼠10個(gè)隱窩杯狀細(xì)胞的數(shù)量，取平均值。

1.4.3免疫組織化學(xué)染色 結(jié)腸組織石蠟切片每張厚4 μm，黏附于防脫載玻片上，60℃烤4 h。常規(guī)脫蠟后，用蒸餾水浸泡3 min，配制檸檬酸鹽修復(fù)液高壓修復(fù)6 min，修復(fù)完后自然冷卻至室溫。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次5 min，甩干后滴加3%過(guò)氧化氫(H2O2)37℃孵育10 min，PBS沖洗3次，每次5 min，甩干水分后每個(gè)組織滴加一滴5%半血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h，PBS沖洗干凈后，加一抗?jié)窈兄?℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗；二抗室溫孵育1 h，PBS沖洗，甩干后臨時(shí)用蒸餾水配制二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，顯色完成后流水沖洗，甩干后滴加蘇木素40 s，鹽酸酒精分化1 s，流水沖洗后脫水，風(fēng)干封片。取圖后分析并計(jì)算增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、β-catenin、GSK-3β表達(dá)。

1.4.4RT-PCR 稱取適量新鮮結(jié)腸組織，提取組織中的總RNA，并用焦磷酸二乙酯(DEPC)水溶解，核酸測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度，計(jì)算D(λ)260/D(λ)280比值，重復(fù)測(cè)定2次，兩次測(cè)得的結(jié)果均在1.8～2.2，且兩次測(cè)得濃度相差不得超過(guò)20 μg/ml。逆轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為25 μl：10.5 μl DEPC水，12.5 μl PCR Master mix (2倍)，Lgr5、Bmi-1、MUC1、MUC2引物上、下游各0.5 μl，然后加入cDNA模板1 μl。β-actin作為內(nèi)參。擴(kuò)增條件：94℃5 min，94℃、30 s，55℃、30 s，72℃30 s，GOTO2，35個(gè)循環(huán)，72℃、5 min，4℃低溫保存。配制2%瓊脂糖凝膠，將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物加入到配制好的凝膠孔中進(jìn)行電泳30 min，凝膠成像儀拍照保存內(nèi)參和目的條帶，運(yùn)用Image J軟件計(jì)算Lgr5、Bmi-1、MUC1、MUC2與β-actin光密度比值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1衰老對(duì)大鼠結(jié)腸組織干細(xì)胞標(biāo)記物L(fēng)gr5、Bmi-1 mRNA的影響 與成年組比較，老年組Lgr5、Bmi-1 mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)圖1，表1。

圖1 兩組結(jié)腸組織Lgr5、Bmi-1 mRNA表達(dá)比較

組別Lgr5Bmi-1MUC1MUC2成年組0.91±0.141.10±0.161.50±0.191.48±0.18老年組0.36±0.121)0.48±0.141)0.72±0.171)0.82±0.111)

與成年組比較:1)P<0.01

2.2衰老對(duì)大鼠結(jié)腸杯狀細(xì)胞數(shù)量及分泌功能的影響 杯狀細(xì)胞可以分泌被PAS染成紅色的中性黏蛋白和被阿利新藍(lán)染成藍(lán)色的酸性黏蛋白。結(jié)果如表1，圖2，表2所示，在結(jié)腸組織中與成年組比較，老年組結(jié)腸組織杯狀細(xì)胞數(shù)量及MUC1、MUC2 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01)。

圖2 各組結(jié)腸組織杯狀細(xì)胞數(shù)量(×200)及MUC1、MUC2 mRNA的變化

組別阿利新藍(lán)染色PAS染色成年組21.83±2.0218.33±0.57老年組14.33±1.891)12.67±1.041)

與成年組比較：1)P<0.01

2.3衰老對(duì)大鼠結(jié)腸組織PCNA蛋白表達(dá)的影響 與成年組比較，老年組大鼠結(jié)腸隱窩PCNA蛋白表達(dá)量顯著增高(P<0.01)。見(jiàn)圖3，表3。

2.4衰老對(duì)大鼠結(jié)腸組織β-catenin、GSK-3β蛋白表達(dá)的影響 免疫組化染色結(jié)果如表3，圖4所示，與成年組比較，老年組大鼠結(jié)腸組織β-catenin蛋白表達(dá)增加，GSK-3β蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

圖3 兩組結(jié)腸組織PCNA表達(dá)(×200)

組別PCNAβ-cateninGSK-3β成年組0.09±0.010.59±0.050.76±0.05老年組0.29±0.042)0.73±0.021)0.39±0.062)

與成年組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

圖4 各組大鼠結(jié)腸組織β-catenin、GSK-3β的表達(dá)(×200)

3 討 論

腸道干細(xì)胞位于隱窩的基底部，是腸道黏膜上皮正常再生及維持腸屏障功能的重要基礎(chǔ)。Barker等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸隱窩底部中表達(dá)Lgr5的細(xì)胞能夠分化成為黏膜中所有細(xì)胞類(lèi)型。在小腸干細(xì)胞中，Lgr5特異性標(biāo)記的CBC主要用于組織更新，Bmi-1特異性標(biāo)記的LRC作為儲(chǔ)備亞群，在組織損傷等情況下被激活。雖然有研究顯示果蠅衰老時(shí)腸道干細(xì)胞的數(shù)量增多、分化成熟的細(xì)胞數(shù)量減少〔11〕，但在衰老過(guò)程中也有許多組織出現(xiàn)干細(xì)胞數(shù)量減少。PCNA可以反映細(xì)胞的增殖能力。前期研究表明，自然衰老大鼠中，小腸組織中Lgr5、Bmi-1、PCNA表達(dá)隨年齡的增加有下調(diào)的趨勢(shì)〔8〕。本研究結(jié)果顯示，自然衰老過(guò)程中，大鼠結(jié)腸組織中Lgr5、Bmi-1 mRNA表達(dá)降低，而PCNA表達(dá)增高，表明衰老過(guò)程中大鼠結(jié)腸干細(xì)胞數(shù)量減少，結(jié)腸干細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。

腸道黏膜的黏液屏障功能的重要生理功能是抵御腸道細(xì)菌、病毒等有害物質(zhì)，因此保持結(jié)腸黏膜完整性至關(guān)重要，而干細(xì)胞是結(jié)腸黏膜再生的基礎(chǔ)。位于結(jié)腸隱窩底部的多能干細(xì)胞可以分化為腸細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞這些最終分化的細(xì)胞〔4〕。腸道黏液屏障重要成分是腸道杯狀細(xì)胞分泌的黏蛋白(MUC)，其中MUC1、MUC2是杯狀細(xì)胞分泌的黏蛋白，對(duì)維持腸道穩(wěn)態(tài)有重要作用。有研究表明老年小鼠腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，MUC1、MUC2表達(dá)降低〔12〕。杯狀細(xì)胞的數(shù)量及分泌功能可以反映結(jié)腸干細(xì)胞的分化功能。本研究結(jié)果顯示，衰老大鼠杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯減少，MUC1和MUC2表達(dá)明顯降低，表明衰老過(guò)程中大鼠結(jié)腸干細(xì)胞向杯狀細(xì)胞分化能力減弱。

腸道干細(xì)胞所處的微環(huán)境對(duì)其功能有重要影響，如Wnt/β-catenin 信號(hào)通路〔13〕。Wnt信號(hào)通路主要是胞膜外的Wnt蛋白結(jié)合卷曲蛋白和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)5/6組成受體復(fù)合物，導(dǎo)致β-catenin聚集，并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，導(dǎo)致一系列干細(xì)胞相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。有研究表明，如將Wnt/β-catenin信號(hào)通路的腺瘤性結(jié)腸息肉病(APC)基因失活或β-catenin過(guò)度活化，小腸增殖將會(huì)出現(xiàn)失控〔14〕。本研究發(fā)現(xiàn)，衰老過(guò)程中，大鼠結(jié)腸組織β-catenin表達(dá)增多、GSK-3β的表達(dá)減少，表明衰老過(guò)程中大鼠結(jié)腸組織的Wnt/β-catenin 信號(hào)通路上調(diào)。

本研究顯示，衰老過(guò)程中結(jié)腸干細(xì)胞數(shù)量減少、增殖能力增強(qiáng)、分化能力減弱，其微環(huán)境Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化。腸道干細(xì)胞是腸道黏膜更新和維持腸屏障功能的重要基礎(chǔ)，衰老過(guò)程中，大鼠結(jié)腸干細(xì)胞數(shù)量、增殖分化功能及其微環(huán)境的改變可能是衰老過(guò)程中一些腸道相關(guān)疾病發(fā)生的重要基礎(chǔ)，本研究對(duì)于進(jìn)一步探討衰老過(guò)程中結(jié)腸干細(xì)胞衰退的機(jī)制、改善衰老相關(guān)腸道疾病提供了一種新的思路。