秦麗紅 秦麗微 王國輝 王麗華 王 辰

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

阿爾茨海默病(AD)是一種與老年人息息相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，病理機(jī)制十分復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制大多與衰老和大腦神經(jīng)細(xì)胞減少有關(guān)，但具體病理機(jī)制亟待研究〔1～3〕。研究發(fā)現(xiàn)AD患者病因多為β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積、老年斑形成，進(jìn)而導(dǎo)致腦神經(jīng)元損傷和死亡〔4〕。最新研究發(fā)現(xiàn)，絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族的Erk1/2、JNK、p38信號(hào)通路在AD的發(fā)生發(fā)展過程中均發(fā)揮著關(guān)鍵作用。MAPKs信號(hào)通路的激活促進(jìn)c-fos蛋白的表達(dá)，可調(diào)控海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡〔5〕。通過調(diào)節(jié)抑制MAPKs信號(hào)通路，可以減輕腦神經(jīng)元的損傷，促進(jìn)損傷神經(jīng)的修復(fù)〔6〕。因此，MAPKs信號(hào)通路可能在AD的發(fā)病進(jìn)展中發(fā)揮非常重要的作用。紅景天對(duì)AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶有非常好的療效〔7〕。本研究主要探討紅景天對(duì)AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬MAPKs通路的影響，以期為AD的病理機(jī)制研究提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 選擇健康雄性Wistar大鼠40只，體重(350±25)g(佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，動(dòng)物飼養(yǎng)室溫(23±2)℃，濕度43%～45%，自由攝食飲水。

1.2藥品與試劑 Aβ25～35購于Sigma生物技術(shù)公司。Erk1/2，JNK和p38的一抗(羊抗鼠)均購于Abcam公司，二抗購于Abcam公司和北京康為世紀(jì)生物有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型建立

1.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將40只健康的雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、假手術(shù)給藥組(予紅景天)、模型組、模型給藥組(予紅景天)。兩個(gè)給藥組每天予紅景天灌胃(25 mg/kg)，持續(xù)30 d，直到取材；模型組與假手術(shù)組同時(shí)灌胃給予等劑量的生理鹽水。

1.3.2動(dòng)物模型建立〔8〕腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠。定位海馬區(qū)參照《大鼠腦立體定向圖譜》，前囟后3 mm，中線向左、右各旁開2.2 mm，硬腦膜下2.8 mm。方法：使用牙科鉆顱骨鉆孔(直徑約1 mm)，微量進(jìn)樣器分別于兩側(cè)緩慢注射Aβ25～35溶液1 μl(10 μg Aβ25～35溶于1 μl無菌生理鹽水制成母液，使用前37℃孵育1 w，使其呈凝聚態(tài)備用)，牙科泥封閉顱骨孔，滴慶大霉素，縫合皮膚并消毒；假手術(shù)組在此位置注入等量生理鹽水，術(shù)后仔細(xì)飼養(yǎng)大鼠，單籠飼養(yǎng)，室溫30℃。

1.4Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)(行為學(xué)檢測(cè))〔9〕在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)各組大鼠提前適應(yīng)性訓(xùn)練3 d，然后采用定位航行實(shí)驗(yàn)連續(xù)3 d檢測(cè)各組大鼠從水里爬上平臺(tái)的時(shí)間，即為逃避潛伏期。

1.5取材 治療30 d后采集標(biāo)本：大鼠斷頭處死，快速剖取腦組織，定位取出海馬組織，立即置入無菌凍存管，-80℃冰箱保存。在藥物干預(yù)后第30天進(jìn)行灌注：①麻醉：腹腔注射戊巴比妥鈉；②打開胸腔，暴露心臟；③左心尖進(jìn)針，迅速用生理鹽水500 ml沖洗掉殘留循環(huán)血液；④500 ml甲醛灌注固定；⑤然后取出腦組織，繼續(xù)放入甲醛中后固定；⑥免疫組化時(shí)進(jìn)行冰凍切片包埋劑(OCT)包埋切片，片厚14 μm。

1.6免疫熒光 采用免疫熒光法染色，檢測(cè)海馬區(qū)Erk1/2、JNK和p38陽性神經(jīng)元的表達(dá)情況：①從-80℃冰箱中取出腦片，復(fù)溫20 min；②0.01 mol磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次；③30% Triton打孔60 min；④0.01 mol PBS沖洗3次；⑤封閉：5%胎牛血清37℃孵育60 min；⑥一抗孵育：Erk1/2，JNK和p38(1∶200，Abcam公司)，4℃過夜；⑦二抗：1∶200，Abcam公司，放入37℃恒溫箱溫育1 h，PBS沖洗；滴加熒光封片劑，封片；⑧熒光顯微鏡進(jìn)行觀察拍攝，利用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.7Western印跡檢測(cè)海馬區(qū)Erk1/2，JNK和p38蛋白的表達(dá)情況 ①在冰上取出海馬區(qū)域，經(jīng)勻漿液離心，提取海馬區(qū)總蛋白，離心超聲波裂解，從裂解液中分離提取生物化蛋白。②組織勻漿后提取蛋白成分變性，蛋白樣品通過聚丙烯酰胺凝膠(積層膠濃度6%，分離膠濃度10%)電泳2 h，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上(濕轉(zhuǎn)300 mA、1.5 h或110 V、1 h)。③轉(zhuǎn)膜后，將膜置于3%胎牛血清溶液中孵育。④加一抗(1∶200)，孵育(4℃，過夜)，含吐溫-20的Tris緩沖液(TBST)中洗一抗。⑤加二抗 (1∶1 000)孵育(室溫，40 min)，TBST中洗二抗，發(fā)光。采用NIH ImageJ軟件進(jìn)行圖像分析，采用軟件Imagine分析圖像灰度。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1紅景天對(duì)各組大鼠逃避潛伏期的影響 與假手術(shù)組相比，模型組連續(xù)3 d逃避潛伏期均明顯延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，模型給藥組逃避潛伏期均明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組逃避潛伏期比較

與假手術(shù)組相比:1)P<0.05，與模型組相比:2)P<0.05；下表同

2.2紅景天對(duì)各組大鼠海馬區(qū)Erk1/2、JNK和p38陽性神經(jīng)元表達(dá)的影響 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組海馬區(qū)Erk1/2、JNK和p38陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯多于假手術(shù)組(P<0.05)；而紅景天干預(yù)組的大鼠海馬區(qū)Erk1/2、JNK和p38陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯少于模型組(P<0.05)，見表2,圖1。

表2 各組大鼠海馬區(qū)Erk1/2、JNK、p38陽性神經(jīng)元表達(dá)

圖1 各組大鼠海馬區(qū)Erk1/2、JNK和p38陽性神經(jīng)元表達(dá)(免疫熒光，×20)

2.3紅景天對(duì)各組大鼠海馬區(qū)Erk1/2、JNK和p38蛋白表達(dá)的影響 Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，AD模型組大鼠海馬區(qū)Erk1/2、JNK和p38的蛋白表達(dá)量多于正常組(P<0.05)；而紅景天藥物干預(yù)組的大鼠海馬區(qū)Erk1/2、JNK和p38蛋白表達(dá)量明顯少于模型組(P<0.05)，見圖2，表3。

圖2 紅景天對(duì)各組大鼠海馬區(qū)Erk1/2、JNK和p38蛋白表達(dá)的影響

組別Erk1/2JNKp38假手術(shù)組0.40±0.050.37±0.060.35±0.05假手術(shù)給藥組0.52±0.050.29±0.060.26±0.04AD模型組0.89±0.051)0.91±0.051)0.92±0.041)模型給藥組0.69±0.062)0.70±0.072)0.63±0.042)

3 討 論

目前對(duì)于AD的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚。臨床表現(xiàn)以老年性遺忘為特征，早期主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性學(xué)習(xí)和記憶能力減退.晚期多因器官衰竭而死亡〔10〕。多數(shù)學(xué)者研究〔1～4〕發(fā)現(xiàn)，AD多為Aβ沉積、老年斑形成導(dǎo)致神經(jīng)元損傷及死亡。研究發(fā)現(xiàn)AD發(fā)病與大腦神經(jīng)細(xì)胞密切相關(guān)，在衰老過程中，大腦神經(jīng)元細(xì)胞減少并發(fā)生病變〔6〕。

MAPKs信號(hào)通路在衰老過程中備受人們關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2通路可影響認(rèn)知，如學(xué)習(xí)、記憶功能等〔11〕。研究發(fā)現(xiàn)，抑制MAPKs通路可以減輕腦神經(jīng)元損傷，促進(jìn)損傷神經(jīng)的修復(fù)〔12〕。體外培養(yǎng)的新生大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入MAPKs通路抑制劑，可導(dǎo)致MAPKs(Erk、JNK、p38)磷酸化水平明顯降低，提示神經(jīng)干細(xì)胞與MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)〔13〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，AD大鼠海馬區(qū)MAPKs(Erk，JNK，p38)與其病理發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。給予紅景天干預(yù)后，大鼠海馬區(qū)MAPKs(Erk，JNK，p38)陽性神經(jīng)元與蛋白明顯減少，AD大鼠的認(rèn)知功能也有所改善。因此，大鼠海馬區(qū)MAPKs(Erk，JNK，p38)激活可以加重AD的發(fā)生發(fā)展，紅景天可以改善AD，其機(jī)制可能與抑制大鼠海馬區(qū)MAPKs(Erk，JNK，p38)的表達(dá)有關(guān)。