李 鑫， 劉鳳永， 袁宏軍， 管 陽(yáng)， 付金鑫， 王茂強(qiáng)

目前臨床上尚未出現(xiàn)原發(fā)性肝癌有效治療方法，其發(fā)生、治療、預(yù)后及進(jìn)展等始終是醫(yī)學(xué)研究熱點(diǎn)和重點(diǎn)［1-2］。大鼠具有基因與人類高度同源、生存能力強(qiáng)、成本低等特點(diǎn)，因此大鼠肝癌模型是研究肝癌相關(guān)問(wèn)題的重要工具［3］。大鼠肝癌模型主要有自發(fā)性肝癌模型、誘發(fā)性肝癌模型、移植肝癌模型及轉(zhuǎn)基因肝癌模型［4］。自發(fā)性肝癌可高度模擬人類肝癌發(fā)生、發(fā)展及相關(guān)基因改變，但成瘤時(shí)間長(zhǎng)、成瘤率低、個(gè)體差異較大［5］，除非有特殊要求，一般很少應(yīng)用。誘導(dǎo)性肝癌模型主要用于化學(xué)物質(zhì)致癌性及肝癌發(fā)生背景等相關(guān)研究［6］，但成瘤數(shù)量不可控、位置不確定性、成瘤周期較長(zhǎng)等使應(yīng)用受限［5］。隨著一系列肝癌細(xì)胞系培育，McA-RH7777和 N1S1細(xì)胞移植性肝癌模型在肝癌治療研究中得到廣泛應(yīng)用［7］。近年以經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞術(shù)（TACE）為代表的腔內(nèi)介入術(shù)對(duì)外科不可切除肝癌的治療效果顯著［8］，介入術(shù)治療肝癌實(shí)驗(yàn)研究逐漸增多［9-10］。 小鼠和裸鼠體積小、血管細(xì)，作為肝癌模型用于肝癌介入治療研究難度較大，而相關(guān)大鼠肝癌模型構(gòu)建研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究采用改良方法較高效地構(gòu)建出上述兩種適用于肝癌介入治療研究的大鼠原位種植性肝癌模型，并通過(guò)彩色超聲、增強(qiáng)CT、MR等影像學(xué)檢查手段實(shí)現(xiàn)診斷和監(jiān)測(cè)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

在生物安全柜（美國(guó)Thermo Fisher科技公司）中，將McA-RH7777肝癌細(xì)胞（美國(guó)菌種保藏中心ATCC，上海苰順生物工程公司）和N1S1肝癌細(xì)胞（ATCC，北京中原領(lǐng)先科技公司）復(fù)蘇后，分別置于含10%胎牛血清和1%雙抗的Dulbecco極限必需培養(yǎng)基（DMEM）和Iscove改良Dulbecco培養(yǎng)基（IMDM）中于37℃、5%CO2孵育箱（美國(guó)Thermo Fisher科技公司）培養(yǎng)。約4 d，貼壁細(xì)胞（McA-RH7777細(xì)胞）用胰酶消化后和懸浮細(xì)胞（N1S1細(xì)胞）（圖1）分別用磷酸緩沖液（PBS）提取制成細(xì)胞懸液。

圖1 10倍光學(xué)顯微鏡下觀察兩種細(xì)胞

1.2 McA-RH7777和N1S1肝癌模型構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)獲得解放軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。20只無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)Sprague-Dawley（SD）大鼠（雄性，12 周齡，350～400 g）由解放軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（合格證：SCXK 2016-0006）提供，隨機(jī)分為McA-RH7777組和N1S1組，每組10只。大鼠稱重、腹腔注射3%戊巴比妥（0.2 mL·100 g-1）麻醉后，腹部備皮，消毒，鋪巾；沿胸骨柄下方腹中線切一長(zhǎng)1～1.5 cm切口，暴露肝左中葉；1 mL注射器于肝中葉中下部斜向上方向進(jìn)針約0.5 cm深度，緩慢注入 0.2 mL 細(xì)胞懸液[（4～5）×106U·mL-1]，肝臟表面肉眼可見(jiàn)一近似圓形透明凸起，凸起點(diǎn)所在位置即建模成功后肝癌所在大體位置，隨后固定注射器2 min讓肝癌細(xì)胞沉淀，防止撤針時(shí)肝癌細(xì)胞從注射點(diǎn)大量流出，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞種植于肝外部位；撤針后棉球壓迫進(jìn)針點(diǎn)5 min，防止腫瘤細(xì)胞從穿刺點(diǎn)流出，導(dǎo)致腫瘤肝外生長(zhǎng)；待注射部位停止出血后，3.0 F縫合線分層縫合切口，并肌內(nèi)注射青霉素（20萬(wàn)U/只，山東魯抗醫(yī)藥公司）和地塞米松（2.5 mg/只，河南潤(rùn)弘制藥公司）。術(shù)后連續(xù)3 d按上述劑量腹腔注射青霉素和地塞米松，以抗感染和免疫抑制治療。兩組大鼠按照上述步驟分別注入McA-RH7777細(xì)胞和N1S1細(xì)胞。

1.3 影像學(xué)檢查

術(shù)后7 d，采用Sonix Touch彩色超聲儀（加拿大Ultrasonix醫(yī)療公司）淺表部位探頭檢測(cè)肝臟腫瘤。增強(qiáng)CT檢查采用Somatom Emotion型16排螺旋CT機(jī)（德國(guó)Siemens公司），24 G靜脈留置針（德國(guó)B.Braun公司）穿刺尾靜脈，碘普羅胺注射液（德國(guó)Bayer公司）0.5 mL于0.9%氯化鈉溶液稀釋1.5～2倍（掃描參數(shù)：130 kV，44 mA，動(dòng)脈期 3～4 s，延遲期13～17 s，層厚 3.0 mm，螺距 0.75～0.95，矩陣 512×512）。MR檢查采用1.5 T超導(dǎo)型MR掃描儀（美國(guó)通用公司），小柔線圈，快速自旋回波（FSE）序列T1加權(quán)成像（TR 400～500 ms，TE 15 ms，矩陣 256×192）和T2脂肪抑制序列掃描（TR 4 500～5 000 ms，TE 102 ms，矩陣 256×256），肝臟軸位掃描野（FOV）均為8～10 cm，層厚3.0 mm、層間距0 mm。記錄模型鼠體重，腫瘤最大長(zhǎng)徑（a）和最大橫徑（b），體積（V）計(jì)算公式：V＝a×b2/2。

1.4 腫瘤大體形態(tài)觀察與病理學(xué)檢查

影像學(xué)檢查篩選出建模成功大鼠，腹腔注射過(guò)量（3～4 mL）10%水合氯醛處死大鼠，觀察兩種腫瘤大體形態(tài)特征，同時(shí)對(duì)兩種腫瘤作常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色，進(jìn)行病理學(xué)檢查。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，率的比較采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況

兩組大鼠術(shù)前術(shù)后飲食和活動(dòng)正常。McARH7777 組（n＝10）大鼠術(shù)前平均體重（382.00±16.02）g，術(shù)后7 d死亡2只，8只影像學(xué)診斷全部成瘤，體重減輕（50.00±24.93） g，建模成功率為80%；N1S1 組（n＝10）大鼠術(shù)前平均體重（373.30±11.60）g，術(shù)后7 d死亡1只，9只全部成瘤，體重減輕（36.44±7.75）g，建模成功率為90%。兩組肝癌模型構(gòu)建成功率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.86）。

2.2 影像學(xué)表現(xiàn)

MR檢查顯示，兩組大鼠肝中葉有單個(gè)腫瘤形成，均為 T1低信號(hào)，T2高信號(hào)（圖 2）；McA-RH7777組腫瘤最大橫徑為（10.20±3.46） mm，體積為（316.43±265.84）mm3；N1S1組腫瘤最大橫徑為（7.98±2.03） mm，體積為（188.58±137.47） mm3。

圖2 McA-RH7777和N1S1肝癌MR檢查影像

彩色超聲檢查顯示，兩組腫瘤均為強(qiáng)回聲結(jié)節(jié)，部分內(nèi)部呈低回聲；多普勒分析顯示腫瘤存在血液供應(yīng)（圖3）。

圖3 McA-RH7777和N1S1肝癌彩色超聲檢查影像

CT平掃未見(jiàn)兩組腫瘤病灶（圖4①④）；增強(qiáng)掃描腫瘤呈“快進(jìn)快出”特點(diǎn)，兩組腫瘤病灶動(dòng)脈期邊緣強(qiáng)化呈高信號(hào)，內(nèi)部壞死呈低信號(hào)（圖4②⑤），靜脈期有明顯廓清現(xiàn)象（圖4③⑥）。

2.3 腫瘤大體形態(tài)

病理檢查結(jié)果與上述3種影像檢查結(jié)果一致，肝中葉注射瘤細(xì)胞處均形成單一腫瘤，其中McARH7777肝癌外觀呈團(tuán)塊狀，N1S1肝癌呈結(jié)節(jié)狀（圖 5）。

2.4 病理學(xué)檢查

圖4 McA-RH7777和N1S1肝癌增強(qiáng)CT檢查影像

圖5 McA-RH7777和N1S1肝癌形態(tài)特征

術(shù)后7 d HE染色結(jié)果顯示，McA-RH7777肝癌為高分化肝細(xì)胞癌，腫瘤細(xì)胞類圓形或多邊形，大小不一，癌細(xì)胞呈結(jié)節(jié)狀排列；N1S1肝癌為低分化肝細(xì)胞癌，癌細(xì)胞多邊形，胞質(zhì)豐富，核大深染，癌細(xì)胞排列呈小梁狀。兩種癌細(xì)胞均存在壞死現(xiàn)象，McA-RH7777肝癌細(xì)胞壞死數(shù)較多于N1S1肝癌細(xì)胞（圖 6）。

圖6 HE染色結(jié)果

3 討論

移植性鼠肝癌模型相比其它鼠肝癌模型，具有腫瘤位置可控、數(shù)量可調(diào)、成瘤時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，是肝癌研究的重要工具。移植性肝癌分為異種移植和同種移植，異種移植通常將人源性肝癌細(xì)胞或其它異源性肝癌細(xì)胞接種至免疫缺陷型裸鼠皮下，在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛［11-12］；同種移植通常將鼠源性肝癌細(xì)胞接種至鼠體內(nèi)，構(gòu)建肝癌模型。同種移植性肝癌模型高度模擬肝癌免疫機(jī)制及腫瘤微環(huán)境改變［13］，是研究肝癌治療的主要工具。隨著醫(yī)學(xué)進(jìn)步，介入技術(shù)在臨床上已廣泛應(yīng)用于肝癌治療［14］。因此，大鼠原位型肝癌模型是肝癌介入治療實(shí)驗(yàn)研究的理想模型［15］。Jin 等［16］通過(guò)將癌細(xì)胞種植于裸鼠皮下獲得瘤組織，隨后在Wistar大鼠肝臟內(nèi)種植瘤塊方法構(gòu)建CBRH-7919肝癌細(xì)胞原位肝癌模型，但該方法操作復(fù)雜，建模需時(shí)4周，周期較長(zhǎng)。本研究通過(guò)向SD大鼠肝臟直接注射瘤細(xì)胞聯(lián)合腹腔注射地塞米松方法，成功構(gòu)建了McA-RH7777和N1S1兩種大鼠原位型肝癌模型。該方法與瘤塊埋植法相比，操作簡(jiǎn)單便捷，省略瘤組織培養(yǎng)過(guò)程，且成瘤時(shí)間短，構(gòu)建相似大小腫瘤模型僅需約1周時(shí)間，即在建模成功率相當(dāng)情況下大大縮短了建模周期。Guo等［17］將 McA-RH7777細(xì)胞和 N1S1細(xì)胞注入SD大鼠肝臟，7 d后成功構(gòu)建兩種大鼠肝癌模型，但成功率僅為75%。本研究通過(guò)改良方法構(gòu)建SD大鼠肝癌模型，7 d后達(dá)到相似大小腫瘤體積，而建模成功率提高至85%（17/20）。此外，通過(guò)改良法構(gòu)建的兩種腫瘤模型高度模擬人類肝癌惡變質(zhì)，McA-RH7777肝癌模型于建模第10日左右出現(xiàn)肝外轉(zhuǎn)移，N1S1肝癌模型則于建模第14日左右出現(xiàn)肝外轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移常見(jiàn)部位為胃腸道、腹腔及淋巴結(jié)；同時(shí)，腫瘤轉(zhuǎn)移伴隨一系列腫瘤相關(guān)性并發(fā)癥，如食欲下降、體重減輕、精神萎靡、癌性腹水等。

此外，本研究采用臨床上常用影像學(xué)檢查手段對(duì)構(gòu)建的兩種原位型肝癌模型進(jìn)行診斷篩查，結(jié)果顯示McA-RH7777和N1S1兩種肝癌模型影像學(xué)表現(xiàn)與人類肝癌影像學(xué)表現(xiàn)相似。因此認(rèn)為，可通過(guò)影像學(xué)檢查觀察兩種肝癌模型腫塊治療效果。本研究總結(jié)認(rèn)為，3種影像學(xué)檢查手段中彩色超聲最為便捷，可用于初步篩查腫瘤模型構(gòu)建是否成功，判斷腫瘤血供情況，同時(shí)初步判斷腫瘤大??；MR檢查最為準(zhǔn)確，通過(guò)T1和T2加權(quán)成像即可實(shí)現(xiàn)肝癌診斷，且可準(zhǔn)確測(cè)量腫瘤大小，是治療后定期觀察腫瘤大小變化的首選檢查工具；CT平掃不易診斷體積較小大鼠腫瘤，須行增強(qiáng)CT掃描，而動(dòng)脈期捕抓時(shí)間較短，對(duì)比劑有一定肝、腎毒性等缺點(diǎn)，因此除特殊需要，一般不建議通過(guò)增強(qiáng)CT評(píng)價(jià)腫瘤大小。本研究?jī)山M大鼠種瘤7 d后，通過(guò)體重減輕程度、MR測(cè)量肝癌體積大小、彩色超聲和增強(qiáng)CT分析模型血供以及肝癌大體形態(tài)、出現(xiàn)轉(zhuǎn)移時(shí)間觀察，組織病理學(xué)檢測(cè)，得出McA-RH7777肝癌比N1S1肝癌生長(zhǎng)更迅速，血供更豐富，惡性程度更高。這一結(jié)論與Guo等［17］對(duì)兩種腫瘤組織病理檢測(cè)后得出的結(jié)論一致。

本研究采用改良法成功高效地構(gòu)建了兩種SD大鼠原位肝癌模型，建模過(guò)程有幾點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)：①注射細(xì)胞懸液時(shí)斜向上方向進(jìn)針可改變進(jìn)針角度，有效防止撤針后進(jìn)針點(diǎn)大量出血。②應(yīng)確保注射細(xì)胞懸液時(shí)肉眼可觀察到肝臟表面有水腫凸起出現(xiàn)，切記不能將肝臟表面撐破，否則會(huì)引起腫瘤細(xì)胞流出肝外；依據(jù)凸起點(diǎn)可初步確定成瘤位置，為后續(xù)影像學(xué)檢查提供初檢位置。③地塞米松注射量應(yīng)個(gè)體化。實(shí)驗(yàn)中大鼠死亡原因很可能是地塞米松注射劑量過(guò)高，致使大鼠免疫力下降，最后死亡。

綜上所述，本研究采用改良法成功構(gòu)建SD大鼠原位McA-RH7777團(tuán)塊狀肝癌模型和N1S1結(jié)節(jié)狀肝癌模型，具有降低種瘤難度，簡(jiǎn)化操作步驟，實(shí)現(xiàn)高效快速建模，縮短實(shí)驗(yàn)周期的特點(diǎn)，并通過(guò)彩色超聲、MR、增強(qiáng)CT成功診斷和評(píng)價(jià)腫瘤，為腫瘤介入治療研究提供了一種可選擇的實(shí)驗(yàn)工具。