馮曉 蔡欣蕊 朱保霖 錢秋海 錢衛(wèi)斌

摘要：目的觀察以健脾補(bǔ)腎、調(diào)肝活血、溫通瀉濁為治法組方的中藥復(fù)方甲榮康對(duì)甲狀腺功能減退模型大鼠卵巢組織InhBP表達(dá)的影響并探討其機(jī)制。方法用他巴唑復(fù)制甲狀腺功能減退大鼠模型，并分為5組（n=10）：模型對(duì)照組、西藥對(duì)照組、甲榮康小、中、大劑量組，另加空白對(duì)照組，分別灌胃。藥物干預(yù)6周后，采用免疫組化方法檢測(cè)各組大鼠卵巢組織InhBP的表達(dá)。結(jié)果甲減模型大鼠卵巢組織InhBP表達(dá)水平明顯升高，甲榮康可顯著的降低模型大鼠卵巢組織InhBP表達(dá)水平，而且隨著劑量的加大，療效更加顯著，明顯優(yōu)于對(duì)照組。結(jié)論InhBP的異常表達(dá)是甲減合并性腺功能減退的發(fā)病機(jī)制之一，通過(guò)健脾補(bǔ)腎、調(diào)肝活血、溫通瀉濁法對(duì)甲減合并性腺功能減退進(jìn)行早期干預(yù)效果明顯，甲榮康可能通過(guò)降低InhBP在模型大鼠卵巢組織中的異常表達(dá)對(duì)甲狀腺及性腺功能起到保護(hù)作用，值得進(jìn)一步深入研究。

關(guān)鍵詞：甲榮康;甲狀腺功能減退;性腺功能減退;InhBP;免疫組化

中圖分類號(hào)：R2855? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? 文章編號(hào)：1007-2349（2018）06-0062-03

Effect of Jiarongkang on InhBP Expression in Ovarian Tissue from Hypothyroidism and Hypogonadism Rats by Immunohistochemistry

FENG Xiao1，CAI Xin-rui2，ZHU Bao-lin3，QIAN Qiu-hai4，QIAN Wei-bin4

（1 .Traditional Chinese Hospital of Dezhou City，Dezhou 253000，China;

2 .Shandong Institute of Occupational Health and Occupational Diseases Prevention and Control，Jinan 250062，China;

3 .Peoples Hospital of Shizhong District of Jinan City，Jinan 250002，China;

4. The Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250011，China）

【Abstract】Objective：To observe the effect of TCM compound Jiarongkang on InhBP expression in ovarian tissue from hypothyroidism and hypogonadism rats and discuss its mechanisms，which is originally aimed to nourish spleen，kidney，liver and bone marrow with alleviating diarrhea Methods：The rat model of hypothyroidism was established by orally administering tapazole and these hypothyroidism rats were divided into 5 groups（n=10 each）：the model control group，the western medicine control group，the Jiarongkang group with low，medium and high doses，additionally the blank control group included All of medications were given orally After 6 weeks of intervention，the expression of InhBP in ovarian tissues was detected by immunohistochemistry Results：The InhBP expression in ovarian tissues from hypothyroidism rats was significantly increased Jiarongkang significantly reduced the expression of InhBP in ovarian tissues in the hypothyroidism rats In addition，the therapeutic effect was more significant with the increase of dose，significantly better than that of the other control groups with tapazole administration Conclusion：Abnormal InhBP expression is one of the mechanisms in hypothyroidism combined with hypogonadism Early intervention of hypothyroidism plus hypogonadism can be effective by nourishing spleen，kidney，liver and bone marrow with attenuating diarrhea Jiarongkang possibly reduces the abnormal expression of InhBP in ovary tissues from the model rats，which plays a protective role in thyroid gland and gonadal function，and remains to be studied

【Key words】Jiarongkang，hypothyroidism，hypogonadism，InhBP，immunohistochemistry

甲狀腺功能減退癥（hypothyroidism），是指由于甲狀腺合成甲狀腺激素減少或組織對(duì)甲狀腺激素抵抗，引起血清甲狀腺激素缺乏或作用發(fā)生障礙而表現(xiàn)出的一組臨床綜合征[1]。近年來(lái)，甲狀腺疾病的發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)，且隨年齡的增長(zhǎng)而增加[2]。本病女性顯著高發(fā)，男女發(fā)病比例為1：4-5。臨床甲減的患者中，男性占01%，女性占19%;亞臨床甲減患病率增高，男為27%，女為71%[3]。本文通過(guò)建立甲減合并性腺功能減退大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察甲榮康對(duì)大鼠卵巢組織InhBP免疫組化表達(dá)水平的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雌性wistar大鼠，體重（200±20）g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（魯）20110003。普通飼料由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供?？偀崃繛?5355J/g（蛋白質(zhì)20%、碳水化合物53%、脂肪9%）。

1.2.藥品及試劑甲榮康，由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科加工而成，由炙黃芪、仙靈脾、巴戟天、仙茅、鹿角膠、肉桂、熟大黃、香附、郁金、當(dāng)歸、荷葉、干姜、白術(shù)等藥物組成，實(shí)驗(yàn)時(shí)制成甲榮康水煎劑。優(yōu)甲樂(lè)（左旋甲狀腺素鈉片），50 ug/片，Merck Gmbh公司生產(chǎn)，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)：H20100523，產(chǎn)品批號(hào)：146548。用研缽把藥品研碎，與生理鹽水配成懸濁液。他巴唑（甲巰咪唑），片劑，50 mg/片，北京市燕京藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)：H11020440，生產(chǎn)批號(hào)：120108。用研缽把藥品研碎，與生理鹽水溶液。一抗Rabbit Anti-inhBP，由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供（bs-9194R）;羊抗鼠/兔二抗檢測(cè)試劑盒，由上海太陽(yáng)生物提供，產(chǎn)品批號(hào)：DD13E001;濃縮型DAB試劑盒，由上海太陽(yáng)生物提供，產(chǎn)品批號(hào)：100E005。

1.3.實(shí)驗(yàn)儀器電子天平，上海天平儀器廠;日本OLYMPUS CKX41-32PH型顯微鏡;德國(guó)Leica ASP全自動(dòng)生物脫水機(jī);德國(guó)Leica ASP2135型超薄切片機(jī);Galanz微波爐;同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)HPLAS100型醫(yī)學(xué)影像分析系統(tǒng)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.造模方法將Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。采用抗甲狀腺藥物的造模方法，藥物劑量按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體表面積比換算而成，即200 g大鼠所需劑量相當(dāng)于成人量×0018，具體給藥：造模大鼠每日灌服004%他巴唑混懸液135 mL（054mg/200 g），共給藥7周。

2.2.分組及給藥將50只造模成功的大鼠隨機(jī)分為以下5組（n=10）：①模型動(dòng)物+生理鹽水組 ②模型動(dòng)物+優(yōu)甲樂(lè)組 ③模型動(dòng)物+甲榮康小劑量組 ④模型動(dòng)物+甲榮康中劑量組 ⑤模型動(dòng)物+甲榮康大劑量組。其中，模型動(dòng)物+生理鹽水組和正常動(dòng)物+生理鹽水組給予等容積生理鹽水灌胃。模型動(dòng)物+甲榮康小劑量組給予甲榮康水煎劑125 g/kg;模型動(dòng)物+甲榮康中劑量組給予甲榮康水煎劑25 g/kg;模型動(dòng)物+甲榮康大劑量組給予甲榮康水煎劑50 g/kg，模型動(dòng)物+優(yōu)甲樂(lè)組按照36ug/kg給藥。每組均每日灌胃1次，給予普通飼料喂養(yǎng)，連續(xù)給藥觀察6周。

2.3.組織標(biāo)本的采集解剖全部大鼠，迅速分別摘取每只大鼠卵巢，去除其周圍的脂肪組織，用生理鹽水沖洗后置4%甲醛中固定，待測(cè)InhBP免疫組化表達(dá)。

2.4.免疫組化方法檢測(cè)卵巢組織InhBP的表達(dá)按照Rabbit SP Kit免疫組化染色試劑盒要求操作。顯微鏡下取10×10視野下觀察標(biāo)本，照相。每張切片鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察陽(yáng)性產(chǎn)物的分布、染色情況。對(duì)每例切片，按Ferrier所采取半定量積分法[4]判斷結(jié)果。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)以（x±s）表示，采用SPSS 170統(tǒng)計(jì)軟件，應(yīng)用Students t檢驗(yàn)，單因素方差分析，以P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示：InhBP主要分布于大鼠卵巢組織，陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物分布于顆粒細(xì)胞中。InhBP在各組大鼠卵巢組織細(xì)胞中均有不同程度的表達(dá)，在模型動(dòng)物+生理鹽水組中InhBP陽(yáng)性顆粒較少，著色較淺，表達(dá)不明顯;而在模型動(dòng)物+甲榮康小、中、大三個(gè)劑量組中，隨著甲榮康應(yīng)用劑量的增高，InhBP陽(yáng)性顆粒增多，著色變深，且呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性。模型動(dòng)物+優(yōu)甲樂(lè)組與模型動(dòng)物+生理鹽水組相比InhBP陽(yáng)性表達(dá)較強(qiáng)，但明顯少于模型動(dòng)物+甲榮康大劑量組。見(jiàn)圖1。

InhBP免疫組化表達(dá)的影響（×100）InhBP免疫組化陽(yáng)性評(píng)分結(jié)果顯示：模型動(dòng)物+生理鹽水組卵巢組織InhBP免疫組化陽(yáng)性積分明顯低于正常動(dòng)物+生理鹽水組（P<005）;模型動(dòng)物+甲榮康小、中、大劑量組與模型動(dòng)物+生理鹽水組相比，InhBP陽(yáng)性積分明顯升高（P<005），并呈現(xiàn)出一定的劑量相關(guān)性，模型動(dòng)物+甲榮康大劑量組與模型動(dòng)物+優(yōu)甲樂(lè)組相比也有明顯差異（P<005）。模型動(dòng)物+優(yōu)甲樂(lè)組InhBP免疫組化陽(yáng)性積分較模型動(dòng)物+生理鹽水組較高（P<005），但低于模型動(dòng)物+甲榮康大劑量組（P<005）。見(jiàn)表1。

5 討論

甲狀腺功能減退癥（甲減）是多種原因引起的甲狀腺激素合成、分泌或生物效應(yīng)不足所致的一組內(nèi)分泌疾病，在我國(guó)臨床甲減的患病率約為1%，各年齡段均可發(fā)病，女性居多，亞臨床甲減的患病率為091%-605%，超過(guò)60歲的婦女中患病率可達(dá)20%[5]。甲減正日益成為威脅國(guó)人健康的隱形殺手。中醫(yī)上甲狀腺功能減退癥可歸屬于虛勞、水腫的范疇。近年來(lái)運(yùn)用中醫(yī)藥治療本病報(bào)道日益增多，中醫(yī)治療甲狀腺功能減退癥在臨床研究、實(shí)驗(yàn)研究也取得一定進(jìn)展。隨著甲減患病率的不斷增長(zhǎng)，選用甲榮方治療甲減，因此，及早的發(fā)現(xiàn)甲減并做到有效的防治，即通過(guò)對(duì)甲減的早期干預(yù)，從而提高甲減患者的生活質(zhì)量具有重大的意義。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，INHB（抑制素B）是排卵前抑制素的主要形式，主要由卵巢顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞合成分泌，對(duì)垂體合成和釋放FSH（卵泡刺激素）起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，并且能直接刺激卵泡膜細(xì)胞合成雄激素[6]。INHB可以作為反映發(fā)育中的卵泡功能的指標(biāo)，且可反映卵巢的儲(chǔ)備功能。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢儲(chǔ)備功能處于衰退中的婦女，其月經(jīng)周期第3天血清INHB降低，血INH的下降是圍絕經(jīng)期出現(xiàn)最早的生化指標(biāo)，可以直接反映卵巢的儲(chǔ)備功能[7]。有兩種蛋白被認(rèn)為是具有代表性的INHR（抑制素受體），即inhBP（抑制素結(jié)合蛋白）和β-多糖，inhBP最初由Chong等[8]從牛垂體中提取，目前在人垂體促性腺激素細(xì)胞和卵巢、睪丸中也已證實(shí)其存在，其發(fā)揮作用的分子機(jī)制是：INH與inhBP結(jié)合后，其跨膜蛋白多糖與ACTRI（激活素受體I）交聯(lián)，阻止ACTRI、ACTRⅡ之間聯(lián)系，使ACTRI不能磷酸化，從而阻斷激活素信號(hào)向細(xì)胞核內(nèi)傳導(dǎo)。另有觀點(diǎn)認(rèn)為，inhBP不能以受體常規(guī)的形式結(jié)合抑制素，因此認(rèn)為[9]，這種蛋白只能促進(jìn)抑制素與激活素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Ⅱ型受體，而不是產(chǎn)生特異的細(xì)胞內(nèi)抑制素傳導(dǎo)信號(hào)，即如果抑制素與激活素通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)形式結(jié)合受體，那么inhBP可提高其親和力。從而發(fā)揮INHB拮抗ACTA的作用，降低對(duì)FSH的反應(yīng)性，繼而調(diào)節(jié)卵泡生長(zhǎng)、優(yōu)勢(shì)選擇。甲減女性患者往往伴隨卵巢功能的減退，根據(jù)INHB及inhBP發(fā)揮作用的機(jī)制，我們推測(cè)，甲減時(shí)inhBP的異常表達(dá)降低了卵巢功能。

研究結(jié)果顯示，甲減時(shí)卵巢組織InhBP數(shù)目明顯增多，陽(yáng)性表達(dá)增高，模型動(dòng)物+生理鹽水組與正常動(dòng)物+生理鹽水組相比有明顯差異（P<001）。經(jīng)灌服甲榮康6周后，模型動(dòng)物+甲榮康小、中、大劑量組的InhBP陽(yáng)性表達(dá)顯著減弱，與模型動(dòng)物+生理鹽水組相比有顯著性差異（P<001）。且模型動(dòng)物+甲榮康大劑量組與模型動(dòng)物+優(yōu)甲樂(lè)組相比，也有明顯差異（P<005）。實(shí)驗(yàn)表明InhBP表達(dá)水平增高可能是甲減導(dǎo)致性腺功能減退的原因之一。

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