丁紅珂 余麗華 曾玉坤 劉玲 盧建 張彥 尹愛華

(廣東省婦幼保健院 醫(yī)學遺傳中心、婦幼代謝與遺傳病重點實驗室，廣東 廣州 511442)

羊水過少是妊娠常見并發(fā)癥，發(fā)病率約0.5%～5.5%[1]，常見于妊娠晚期。在沒有泌尿生殖系統(tǒng)結構異常的情況下，中孕期晚期超聲檢查顯示羊水過少，應考慮腎小管發(fā)育不良(renal tubular dysplasia，RTD，OMIM：#267430)的可能[2]。RTD是一種以圍產期死亡為主要特征的常染色體隱性遺傳性疾病，是由于腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)的任何一種基因失活所致，其中血管緊張素Ⅰ轉換酶(ACE)就是其中之一[3]。ACE是一種金屬肽酶，屬于谷胱甘肽金屬蛋白酶家族[3]。人類循環(huán)和組織中的ACE水平部分由ACE基因多態(tài)性決定[4]。

在小鼠中，ACE基因完全失活是可存活的，而在人類則導致嚴重低血壓、腎灌注不足和RTD，這是一種以出生時無尿或嚴重腎功能不全、缺乏腎近端小管分化和常見的圍產期死亡為特征的嚴重腎臟疾病[5]。目前人類ACE基因突變的臨床病例致病性報道比較有限。有報道稱ACE基因的純合突變或復合雜合突變會導致RTD的發(fā)生，臨床表現(xiàn)主要為嚴重的羊水過少、出生時的腎功能不全及出生后短時間內的死亡[6]。在某些情況下，腎功能不全者需要出生之后的長期腹膜透析，例如發(fā)生Q1069R錯義突變，導致ACE活性完全缺乏[7,8]。

本研究在1例兩次妊娠均出現(xiàn)胎兒雙腎回聲增強、羊水過少的家系中，通過對核心家系的高通量測序發(fā)現(xiàn)胎兒ACE基因復合雜合突變c.1028G>A(p.W343*)和c.2948T>C(p.L983P)，分別來自父母雙方。其中c.2948T>C至今未在相關病例中報道過，為新發(fā)現(xiàn)的突變。2個位點在物種間均保守，其中c.1028G>A人群頻率非常低，可導致蛋白截斷，并在RTD病例中被報道過[6]；c.2948T>C尚無人群數(shù)據(jù)，生物信息學預測為有害突變。針對發(fā)現(xiàn)的ACE基因突變該家系進行了PGD，植入不含有這2個突變的胚胎，并于妊娠18周抽取羊水進行基因確診，證實胎兒未攜帶父母突變，同時超聲監(jiān)測也未發(fā)現(xiàn)胎兒羊水和腎臟的異常。據(jù)此判斷，本研究發(fā)現(xiàn)的2個突變位點很可能就是導致胎兒異常的原因，擴充了ACE基因的突變譜。

1 對象與方法

1.1 研究對象 33歲孕婦，停經25+周時，外院超聲發(fā)現(xiàn)胎兒雙腎回聲增強，羊水極度過少(最大羊水深度<20mm)來本院產前診斷中心就診，分析胎兒預后不良可能，孕婦及家屬決定終止妊娠，并對胎兒進行相關遺傳學分析。既往史：曾因孕29周發(fā)現(xiàn)胎兒雙腎回聲增強、羊水過少引產1次。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 經孕婦及家屬知情同意，終止妊娠時抽取胎兒臍帶血1ml及父母外周血2ml(EDTA-Na抗凝)進行相關遺傳學檢測，包括常規(guī)染色體及微陣列檢測和必要時的高通量測序。PGD術后，孕18周時在超聲引導下行羊膜腔穿刺術抽取胎兒羊水5～8ml，羊水DNA提取使用德國Qigen公司生產的Qiamp DNA Blood Mini Kit提取試劑盒進行基因組DNA提取。

1.2.2 染色體核型分析 采用G顯帶制備技術對臍血及外周血進行常規(guī)G顯帶(500～550條帶)檢測。

1.2.3 染色體微陣列分析(CMA) 使用美國Affymetrix公司生產的CytoScan 750k芯片和擴增、雜交試劑盒進行CMA檢測。參照Infinium HD Assay標準操作流程進行操作，檢測結果使用Chromosome Analysis Suite(Ch AS；version 2.1)軟件進行分析。結果判讀參照DGV、ISCA、OMIM、DECIPHER等數(shù)據(jù)庫。

1.2.4 高通量測序 進行醫(yī)學外顯子(目前與人類疾病相關的4000個基因)父母胎兒(第二胎)核心家系高通量測序，包括50 584個編碼區(qū)對應8 421 879個堿基，包含外顯子與內含子交界區(qū)。使用HiSeq2000測序儀(Illumina, Inc., San Diego, CA)。

1.2.5 Sanger測序 針對高通量測序發(fā)現(xiàn)的疑似致病位點進行一代驗證。同時該方法也用于PGD術后胎兒羊水DNA檢測確定基因型。

1.2.6 序列比對 參考序列數(shù)據(jù)來自UCSC Genome Browser(http:∥genome.ucsc.edu)數(shù)據(jù)庫，序列版本號：GRCh37/hg19。

1.2.7 植入前診斷 第二次妊娠異常胎兒發(fā)現(xiàn)基因突變后，告知單基因病致病位點意義不明確的相關遺傳學再發(fā)風險，家屬要求進行PGD。首先針對父母及第二次有問題的胎兒進行家系單倍型構建，以ACE基因(NM_000789.3 chr17:61554422-61575741 正向轉錄)編碼區(qū)為目標區(qū)域，并在基因上下游選擇若干SNP位點作為遺傳標記，高通量測序，檢測SNP 位點基因型，選擇其中相應位點構建單體型，進行連鎖分析。通過分析父母來源的疑似致病位點單倍型間接判斷胚胎基因型，選擇未攜帶父母疑似致病位點的胚胎移植。移植成功后，孕18周行羊膜腔穿刺進行基因確診。

2 結果

2.1 常規(guī)遺傳學檢測 第一胎外院檢測提示胎兒染色體、比較基因組雜交(CGH)結果未見異常，未做進一步基因檢測。第二胎胎兒臍血染色體核型及染色體微陣列分析未見異常。

2.2 高通量測序及致病性分析 父母胎兒(第二胎)外顯子測序發(fā)現(xiàn)胎兒ACE基因(NM_000789.3)復合雜合疑似致病突變c.1028G>A(p.W343*，rs200225958)和c.2948T>C(p.L983P)，分別遺傳自父親(c.1028G>A)和母親(c.2948T>C)。其中c.1028G>A位點，數(shù)據(jù)庫收錄的人群頻率為：A=0.0002/1 (1000 Genomes)和A=0.00002/3 (TOPMED)。該位點突變屬于無義突變，可導致第343位氨基酸密碼子變?yōu)榻K止密碼子，從而使肽鏈合成提前終止，最終形成比野生型蛋白少了963個氨基酸的截斷蛋白，預測可嚴重影響蛋白功能。c.2948T>C位點數(shù)據(jù)庫未見報道，該位點變異屬于錯義突變，可導致第983位氨基酸從亮氨酸(L)變?yōu)楦彼?P)，生物信息學軟件預測提示為有害突變(http:∥provean.jcvi.org/index.php)。

2.3 一代驗證 分別針對ACE基因c.1028G>A和c.2948T>C位點進行父母胎兒的Sanger測序(圖1)提示，胎兒復合雜合，父母均為雜合攜帶。

圖1 家系一代驗證測序圖

2.4 位點保守性分析ACE基因c.1028G>A和c.2948T>C位點的物種間較保守性序列比對(圖2)，提示兩位點在不同物種間高度保守。

圖2 物種間保守性序列比對

2.5 PGD術前單倍型構建 選取其中8個ACE基因上下游SNP位點進行單倍型圖繪制(圖3，其余SNP位點未顯示)，紅色(GCCTCTGT)和紫色(GCCTCTGT)分別代表來自父親和母親的致病單倍型。選取不含GCCTCTGT單倍型的胚胎植入(胚胎單倍型未畫出)。

圖3 家系單倍型構建

2.6 PGD術后胎兒羊水DNA檢測 第三次妊娠胎兒未攜帶父母雙方的疑似致病位點(圖4箭頭所指)。超聲監(jiān)測未發(fā)現(xiàn)胎兒腎臟和羊水量異常。

3 討論

本研究在1例超聲提示腎臟增大、羊水嚴重過少的胎兒中檢測到ACE基因復合雜合變異，分別遺傳自父母雙方，符合常染色體隱性遺傳規(guī)律。發(fā)現(xiàn)的c.2948T>C變異位點未見與疾病相關性報道，為本次研究新發(fā)現(xiàn)的變異位點，通過生物信息學及家系遺傳學分析提示可能與疾病相關。在告知了單基因病致病位點意義不明確的相關遺傳學風險之后，家屬要求進行PGD，并對PGD術后妊娠胎兒進行基因檢測，提示未攜帶父母雙方變異位點，且超聲未見腎臟和羊水量的異常情況，間接提示本研究發(fā)現(xiàn)的位點很可能就是導致該家系第一胎和第二胎發(fā)育異常的原因。

RAS表達于人類腎臟發(fā)育的早期，人類早在孕30～35天時就能檢測到ACE及其他組成部分[9-11]。RAS在人類腎臟發(fā)育中的作用進一步被遺傳性RTD的報道所證實，RAS組分中的任何一個主要基因失活均可能導致RTD[5]。Gribouval等[6]報道了17個RTD家系，其中由7個不同的ACE基因突變引起的RTD病例中，除1例外所有病人均有嚴重的羊水過少及出生后幾小時內死亡，其中9個病例是ACE基因的純合突變，3個病例是復合雜合突變。存活的個體出生時出現(xiàn)羊水過少和嚴重的腎功能不全(血漿肌酐為370 mmol/L)，后腎功能出現(xiàn)自發(fā)性恢復，在出生后3周內血肌酐處于正常范圍(45 mmol/L)[6]。本研究家系兩次妊娠均出現(xiàn)胎兒羊水過少的情況，符合RTD的胎兒期臨床表現(xiàn)，因胎兒均被引產未出生，無法準確評估胎兒的腎功能，且兩次引產的胎兒家屬拒絕行尸解及病理檢測，我們并未了解胎兒腎小管發(fā)育情況，但根據(jù)超聲提示胎兒雙腎回聲增強，不排除存在腎小管發(fā)育不良的可能，因為腎小管發(fā)育不良的個體中會有一部分病例表現(xiàn)為超聲下腎實質回聲增強[12]。該家系兩次妊娠均表現(xiàn)為羊水過少，且超聲未發(fā)現(xiàn)胎兒腎臟的明顯結構異常，提示RTD可能性大，現(xiàn)有臨床表現(xiàn)符合RTD文獻描述。

本次實驗發(fā)現(xiàn)的兩個變異位點，c.1028G>A屬于無義突變，已在RTD病例中被報道，在一個土耳其家系中發(fā)現(xiàn)該位點純合突變，在一個挪威家系中發(fā)現(xiàn)了該位點與其他位點的復合雜合突變[6]。該突變可以使腎素表達明顯增加，這可能是由于ACE的功能缺乏，以及血管緊張素Ⅱ的產生及其對腎素產生的負性調控所致[6]。c.2948T>C為錯義突變，尚無人群頻率數(shù)據(jù)， L983P 位于ACE 蛋白的C端

圖4 植入胚胎產前診斷

結構域(L613-P1193)，且距離催化中心位置(H959-H963)[3]非常近，推測L983P可能通過空間構象的改變影響ACE蛋白的催化功能，但以上兩個變異位點如何真正影響蛋白功能仍需要進一步的功能驗證和分析。