王梓茗 尹愛華

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣東省婦兒醫(yī)院 醫(yī)學(xué)遺傳中心， 廣東 廣州 511442)

地中海貧血是中國南方地區(qū)最常見的單基因遺傳病，是珠蛋白基因缺陷所致珠蛋白合成障礙引起的溶血性疾病，根據(jù)異常累計的珠蛋白基因分為α和β地中海貧血。α地中海貧血，患病率達到7.88%，其中患病率最高的是廣西(14%)，其次為廣東；β地中海貧血患病率為2.21%[1]。重型α地中海貧血具有胎兒致死性，可在宮內(nèi)發(fā)生胎兒水腫或死亡，發(fā)生于夫婦均為α0地中海貧血基因攜帶者的家庭，再次懷孕仍有1/4的概率懷有重型患兒，為家庭帶來沉重心理負(fù)擔(dān)。中重型的β地中海貧血患兒可在出生后3～6月出現(xiàn)逐漸加重的溶血性貧血癥狀，缺乏特異性治療手段，患兒依賴長期輸血和除鐵治療存活，預(yù)期生存時間顯著縮短，為患兒家庭帶來沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)和社會負(fù)擔(dān)。目前主要依賴絨毛活檢、羊水穿刺及臍血穿刺等有創(chuàng)方法獲得胎兒基因信息，檢測時間窗較窄、具有胎兒損傷風(fēng)險、實驗室診斷周期較長、工作量大，因此需要早期、快速、精準(zhǔn)、無創(chuàng)、安全的分析方法。盡管有報道顯示超聲方法可以發(fā)現(xiàn)重型地中海貧血[2, 3]，但該指標(biāo)缺乏特異性，不能有效預(yù)測地中海貧血的發(fā)生。分子診斷方法仍是預(yù)測地中海貧血的首選方法。隨著無創(chuàng)產(chǎn)前篩查(non-invasive prenatal testing, NIPT)染色體異常的技術(shù)得以應(yīng)用和成熟，孕婦血漿中胎兒DNA成分成為檢測胎兒基因組的重要工具，相較于有創(chuàng)方法取樣更簡便，更容易被接受，針對單基因病的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷(non-invasive prenatal diagnosis, NIPD)是必然趨勢。精確定量技術(shù)，包括高通量測序平臺和數(shù)字PCR，及其數(shù)字化定量策略，使得NIPD更加精確、更具有針對性，使得無創(chuàng)產(chǎn)前診斷更具有實用意義。這對于預(yù)防和控制地中海貧血具有重要意義。本文將主要綜述地中海貧血無創(chuàng)產(chǎn)前診斷新技術(shù)的應(yīng)用。

1 胎兒游離DNA

1997年，Lo[4]在懷有男性胎兒的孕婦血漿中檢出Y染色體序列，證實了胎兒游離DNA(cell-free fetal DNA, cffDNA)的存在，為無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)的出現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)。cffDNA主要由進入母血循環(huán)中的胎盤滋養(yǎng)層細胞凋亡后釋放[5]，因此cffDNA長度具有143bp和166bp峰，這是基于分子大小富集胎兒成分的基礎(chǔ)；同時cffDNA主要反映胎盤滋養(yǎng)層的基因狀態(tài)而非胎兒本身。cffDNA中包含胎兒完整基因組信息是進行胎兒單基因病及染色體異常檢測的分子基礎(chǔ)；胎兒特異性基因片段是實施單基因遺傳病無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的技術(shù)基礎(chǔ)。cffDNA僅為血漿游離DNA(cell-free DNA, cfDNA)的一部分，常使用胎兒濃度(fetal fraction, FF%)表示，其余成分為母親來源的DNA成分，構(gòu)成無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的背景雜音。FF%是制約無創(chuàng)產(chǎn)前檢測精度和靈敏度的重要困境，也是導(dǎo)致假陰性結(jié)果的重要因素。在孕5周即可檢出，胎兒成分僅占3%[6]，并隨孕周增加而增加；而在孕10周，胎兒成分約為10%，并以每周0.1%速度增加，到孕21周后，以每周1%速度增加，然而仍有部分孕婦血漿中胎兒濃度低于4%，統(tǒng)計顯示，孕婦體重過高也與胎兒濃度過低有關(guān)[7]。在基于普通PCR或熒光定量PCR的方法中，過低的胎兒濃度將導(dǎo)致胎兒特異性位點無法有效擴增，或胎兒成分引起的目標(biāo)序列增加過少，低于檢測技術(shù)的檢測閾值，而得出假陰性的結(jié)果。因此，需要選擇合適的抽血時間窗和胎兒濃度質(zhì)控方法，同時利用數(shù)字化定量平臺將低濃度的胎兒成分如實地反映出來，是無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)的要求。

2 高通量測序技術(shù)

高通量平行測序(massive parallel sequencing, MPS)是最為常用的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)平臺，該平臺可同時分析數(shù)百萬條DNA分子，借助測序后的生物信息學(xué)分析還原出胎兒染色體及基因型、單體型狀態(tài)，從而實現(xiàn)對胎兒染色體異常的篩查以及單基因病的產(chǎn)前診斷。MPS對cfDNA中大量分子平行測序，使其在測序的基礎(chǔ)上可進行數(shù)字化定量，其檢測的reads數(shù)十分龐大，使其具有對染色體數(shù)目異常、基因組改變的檢測能力，揭示胎兒成分的相應(yīng)分子reads數(shù)的增加或減少。目前，已形成較成熟的技術(shù)應(yīng)用于21-三體、13-三體及18-三體等常見染色體數(shù)目變異的疾病的篩查[8]。且現(xiàn)有技術(shù)可在低至4%[7]的胎兒濃度仍能保證準(zhǔn)確地判斷單胎染色體核型。

MPS可以同時檢測大量的SNP位點，利用胎兒特異性SNP位點繪制胎兒基因組圖譜[5]，構(gòu)建出胎兒單體型，從而分析遺傳自父母雙方的等位基因。由于致病突變和野生型堿基分別與特定單體型緊密連鎖，胎兒特異的單體型可以反映胎兒遺傳自父母雙方的等位基因。其中包括連鎖分析方法和相對單體型劑量(relative haplotype dosage, RHDO)[5, 9]。由于cffDNA中胎兒成分非常少，致病突變常難以有效檢出，結(jié)合單體型構(gòu)建和連鎖分析可以明確是否遺傳自父親的突變或野生型基因，檢測靈敏度高；連鎖分析方法也是父母雙方攜帶相同突變類型時的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷方法。RHDO原理是胎兒與母親共有一半的單體型，盡管無法與母源背景中的單體型區(qū)分，母胎共有的單體型在cfDNA中相對過多，進而判斷胎兒遺傳自母親的單體型及其關(guān)聯(lián)的野生型或突變型基因[10]；Wang W[11]則將該方法改良為借助隱馬爾科夫算法估計胎兒遺傳自父母的相應(yīng)基因。相對突變劑量(relative mutation dosage, RMD)分析策略與RHDO方法類似，是利用突變型與野生型序列在孕婦血漿中相對含量，判斷胎兒的基因型，也可以應(yīng)用到SNP及單體型的分析中，不僅分析在母親純合而胎兒雜合的SNP位點，同樣可適用于母親雜合的SNP位點，借助SNP兩種堿基含量是否平衡判斷胎兒在該SNP位點狀態(tài)。RHDO策略及RMD策略的出現(xiàn)改變了傳統(tǒng)借助差異性分子標(biāo)記或父源突變位點進行排除性診斷的局限性。

目標(biāo)序列捕獲測序是通過特異性捕獲探針或捕獲芯片對短片段的DNA，從而僅針對特定的基因序列的進行測序分析，測序成本較全基因組測序低，對目的基因覆蓋度及測序深度更高，充分利用檢測區(qū)域的SNP及單體型信息。擴增子測序不依賴定制芯片，針對已知突變的目標(biāo)區(qū)域擴增，靶向更強，成本更低，時間更短，但在多重擴增反應(yīng)中難以保證均一性。針對目標(biāo)區(qū)域訂制探針成本，不僅訂制周期長，且面臨捕獲的均一性、捕獲條件的優(yōu)化、捕獲cfDNA的效率和特異性等問題，需漫長摸索。而擴增子測序常擴增較短片段的擴增子，若需要覆蓋距離較遠的多個突變則需要多個擴增子覆蓋，而地中海貧血遺傳異質(zhì)性大，突變分布范圍廣，需要根據(jù)不同的檢測位點設(shè)計相應(yīng)的引物，尤其是多重擴增體系優(yōu)化較為繁瑣。Xiong L[12]僅用一對引物擴增的擴增子，構(gòu)建可覆蓋4種位置相鄰的β地中海貧血突變的panel，并結(jié)合RMD策略分析胎兒是否遺傳母親的突變；然而在其另一篇研究中則需要使用3對引物擴增3個重疊的擴增子，從而構(gòu)建覆蓋4種突變類型的panel，但該策略僅進行父源排除性診斷，難以進行上述RHDO、RMD檢測策略。

3 數(shù)字PCR

3.1 數(shù)字PCR技術(shù)原理 數(shù)字PCR是一種高通量、自動化、精確定量技術(shù)，結(jié)合微流控技術(shù)和雙熒光通道檢測，可以對目標(biāo)分子數(shù)進行絕對定量。目前包括Bio-Rad Laboratories公司的 QX100和QX200平臺為代表的微滴數(shù)字PCR和Life Technologies 公司的QuantStudio? 3D數(shù)字PC系統(tǒng)微流控芯片數(shù)字PCR。數(shù)字PCR是一種單分子計數(shù)技術(shù)，其原理是將熒光定量反應(yīng)體系分散到上萬個小體積的分隔室中，每個分隔室中包含完整的PCR反應(yīng)液及單拷貝DNA模板，在PCR的過程中每個分隔室獨立進行反應(yīng)，只有含目標(biāo)分子的分隔室經(jīng)擴增產(chǎn)生熒光。在完成PCR完成后對熒光信號進行分析，通過雙熒光通道(FAM/HEX或FAM/VIC)對所有分隔室分析，可同時對兩種目標(biāo)分子進行定量。

數(shù)字PCR大致可分為分散體系生成、PCR反應(yīng)及熒光信號分析步驟，其使用的反應(yīng)體系與熒光定量PCR相似，具有簡便、可操作性強的優(yōu)點。而由于同時對上萬個平行的擴增反應(yīng)單元進行分析，尤其微滴式數(shù)字PCR可在單孔中同時進行20 000個平行反應(yīng)；微滴式數(shù)字PCR在一塊96孔板中同時進行96重反應(yīng)，芯片式數(shù)字PCR僅能進行若干個陣列的反應(yīng)，因此微滴式數(shù)字PCR具有通量優(yōu)勢；而相較于高通量平行測序而言，則具有周期短、成本低的特點。數(shù)字PCR常采用Taqman水解探針法，特異性高，針對性強，可直接檢測微量突變并精確定量其拷貝數(shù)，結(jié)果分析可在分析儀自帶的軟件完成計算，生物學(xué)分析更為簡便、快速，準(zhǔn)確性高；而高通量平行測序依賴于后續(xù)的生物學(xué)分析，分析周期較長、過程復(fù)雜，對突變位點的檢測受單堿基的檢測深度及測序質(zhì)量的影響。盡管如此，數(shù)字PCR和其他PCR檢測方法一樣，只能針對已知的突變進行檢測。

數(shù)字PCR只能同時分析兩種熒光信號，選擇較實時定量PCR局限，不能在單管中同時對多個位點進行分型；而在定量方面相較實時定量PCR準(zhǔn)確度更高、檢測閾值更低，可檢測單個拷貝或單個目標(biāo)分子，且在復(fù)雜的背景中或存在高濃度、高度同源序列的背景中檢測出稀有的、單個堿基突變具有顯著的優(yōu)勢。這主要是由于數(shù)字PCR將單分子的模板分散到每個小的反應(yīng)體系中，從而每個反應(yīng)體系只擴增單一模板，減少了模板分子之間的競爭或抑制作用，減少了等位基因脫扣或母源非特異性擴增的發(fā)生。

3.2 地中海貧血 人類珠蛋白基因簇比較長，遺傳異質(zhì)性大，致病類型包括缺失型和非缺失型，其引物和探針設(shè)計策略不同，例如大片段的缺失常使用跨越斷裂點擴增(Gap-PCR)方法。且突變可發(fā)生于基因簇上相距較遠的多個熱點位點，往往需要設(shè)計多對引物和探針才能覆蓋。然而，某些突變在人群中的頻率相較于其他突變高，其后代容易形成純合子或復(fù)合雜合子而導(dǎo)致中至重型地貧。因此，針對常見突變設(shè)計特異性引物及探針，可實現(xiàn)對大多數(shù)重型地中海貧血的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷。此處將針對β及α地中海貧血分別進行闡述。

3.2.1 β地中海貧血 β地中海貧血常由突變引起，常由于框移突變、無義突變、剪接位點突變等原因無法生成正常的β珠蛋白，進一步導(dǎo)致了α、β肽鏈比例失衡，造成溶血的發(fā)生。父母均為致病突變攜帶者時，胎兒有1/4概率同時遺傳來自父母親的致病突變，導(dǎo)致中重型地中海貧血，因此需要行產(chǎn)前診斷明確胎兒基因型(圖1a)。這樣可以免除1/2非必要的有創(chuàng)操作，減少胎兒在介入性檢查的風(fēng)險。大多數(shù)情況，父母攜帶兩種不同的致病突變，則可通過排除法策略進行無創(chuàng)產(chǎn)前診斷。當(dāng)父親攜帶的致病突變在孕婦血漿游離DNA中檢出，則表明胎兒遺傳了來自父親的致病突變，此時胎兒有1/2的概率同時遺傳了來自母親的突變基因形成重型地中海貧血，需要進行進一步的介入產(chǎn)前診斷。而該方法可通過熒光實時定量PCR檢測，或結(jié)合肽核酸夾[13]、COLD-PCR[14]等技術(shù)富集突變基因，可降低檢測的閾值，應(yīng)用于早期妊娠的樣本檢測。但是肽核酸夾設(shè)計比探針復(fù)雜，COLD-PCR的反應(yīng)條件優(yōu)化困難，且富集效果有限，較低的變性溫度也可能引入非特異性擴增。數(shù)字PCR靈敏度高、定量精確、檢測閾值較低，可直接檢測單分子水平的模板而無需額外富集。

然而，由于cfDNA缺乏分子水平的特異標(biāo)記，胎兒遺傳自母親的等位基因常被孕婦血漿中DNA背景所覆蓋，即母體來源游離DNA背景中本身已包含了野生型、突變型兩種序列，而胎兒來源的野生型或突變型序列都無法和母體來源的DNA相區(qū)別，使得1/4并未遺傳母親的突變基因的胎兒仍需接受介入性產(chǎn)前診斷。Lun[15]提出了一種相對突變劑量( relative mutation dosage, RMD)方法，可根據(jù)野生型和突變型基因是否存在不平衡而對于父母雙方攜帶不同突變的案例，母親攜帶的突變位點上的基因型為雜合N/M，而父親在該位點上的基因型為純合野生型N/N，其后代只可能形成兩種狀態(tài)，即N/N或N/M。理論上，對于母親攜帶的致病突變類型，母體細胞釋放至血漿的序列野生型和突變型序列相等，但是混入一定比例的胎兒來源的DNA后，若胎兒基因型為N/N，即只釋放野生型的序列，可導(dǎo)致cfDNA中野生型序列比例多于突變型；若胎兒基因型為N/M，該平衡不會打破(圖1b)。該方法結(jié)合父源致病基因排除診斷，可確定胎兒的基因型，理論上只有同時遺傳父母突變的病例需要進一步行介入性產(chǎn)前診斷。

由于胎兒成分濃度在孕婦血漿中含量極低，胎兒成分并不導(dǎo)致突變型序列劑量成倍增加或減少，變化幅度低于qPCR檢測閾值，因此需要在更精準(zhǔn)的數(shù)字化定量平臺上檢測，利用樣品中兩種分子絕對數(shù)量上的差異判斷是否存在不平衡。Lun[15]通過性染色體特異序列構(gòu)建的ZFX/ZFY算法結(jié)合胎兒濃度的檢測，結(jié)合SPRT算法，將樣品得出等位基因含量與特定胎兒濃度下預(yù)期等位基因相對含量對比進行分型，10例中僅5例準(zhǔn)確分型，未能準(zhǔn)確分型的樣品胎兒濃度<10%。而Camunas-Soler[16]用同種方法對包括β地中海貧血在內(nèi)的多種常染色體隱性及X連鎖隱性遺傳病進行檢測，在預(yù)擴增的基礎(chǔ)上進行47個SNP位點分析估算胎兒濃度，在低至3.7%的胎兒濃度下可準(zhǔn)確判別胎兒是否遺傳了母親的致病突變。因此，該策略可應(yīng)用于多種點突變相關(guān)的單基因遺傳病，具有普適性。然而，減少檢測過程中母源背景信號對于結(jié)果的判別仍然是該策略推廣的重要難題。

3.2.2 α地中海貧血 --SEA缺失型是我國南方最常見的α0-缺失型基因，攜帶率高達2.54%[1]。父母雙方為--SEA攜帶者，或者其中一方或雙方為HbH病患者。因此，研究中多以排--SEA純合所致Bart水腫胎為主要目的。但由于父母攜帶相同的致病基因，在孕婦血漿中多無法區(qū)分出胎兒來源的序列，排除法策略排除父親來源的致病基因需要依賴個體特異的遺傳標(biāo)記，如單堿基多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)[17]、短重復(fù)序列(short tandem repeat, STR)[18]。然而，某些多態(tài)性位點在人群中頻率過低，缺乏臨床意義；而在有限的目標(biāo)區(qū)域內(nèi)，多態(tài)性位點有限，且常因父母雙方均攜帶相同的SNP位點而無法獲得足夠數(shù)量具有差異的多態(tài)性位點，這些都局限了遺傳標(biāo)記連鎖策略的應(yīng)用。數(shù)字PCR平臺單孔檢測通量有限，同時檢測大量不僅工作量大，步驟繁瑣，并不具有實用性。相對突變含量檢測法是更為可行的選擇。

與點突變的相對定量方法不同的是，包含野生型及突變型Gap-PCR引物設(shè)計方法跨越--SEA缺失序列兩端設(shè)計引物，特異性擴增包含斷裂點的序列；并在缺失片段內(nèi)設(shè)計引物，從而擴增相應(yīng)野生型的片段(圖2a、b)。Pornprasert[19]利用野生型及缺失型序列的拷貝數(shù)比例準(zhǔn)確地區(qū)分了正常樣本、攜帶者樣本及--SEA純合樣本。由于父母攜帶相同缺失類型(圖1c)，此時有3種情況，即胎兒為攜帶者時，cfDNA中野生型和突變型序列含量接近；胎兒為正?；蛐突?-SEA純合時分別導(dǎo)致野生型和缺失型序列過多。這樣增大了結(jié)果分析的困難性，易將Bart水腫胎誤診為攜帶者而造成漏診，因此需要足夠精確的定量方法和生物信息分析方法以排除假陰性結(jié)果。Sirichotiyakul[20]用qPCR方法可以檢測出懷有Hb Bart水腫胎的孕婦血漿中ΔCT(CT缺失-CT野生)較正常胎兒及雜合型胎兒更高，是可行的檢測策略，可以通過數(shù)字PCR將這種CT上的差異轉(zhuǎn)化為分子絕對數(shù)量上的差異，提高檢出率。

圖1 數(shù)字PCR無創(chuàng)產(chǎn)前診斷策略 圖2 α地中海貧血擴增策略

拷貝數(shù)檢測方法可用于基因拷貝數(shù)改變引起的疾病，而缺失型α地中海貧血引起的α珠蛋白拷貝數(shù)減少或缺用該方法檢測。參照序列常選用正常基因組中雙拷貝的基因序列。目標(biāo)序列選取可分為兩種：①斷裂區(qū)域內(nèi)無同源性的區(qū)域(圖2c)，Long[21]選取缺失區(qū)內(nèi)非同源區(qū)域與參照基因的產(chǎn)物峰面積進行對比，即采用了該策略。對于α0-攜帶者而言，基因組僅有一半的α野生型序列，因此目標(biāo)序列應(yīng)為參照基因的一半，而當(dāng)胎兒的缺失型基因參入后，野生型序列被進一步稀釋而比例降低，借助數(shù)字化定量的方法，直接反映初始模板中目標(biāo)分子拷貝數(shù)，將這種改變呈現(xiàn)為目標(biāo)序列拷貝數(shù)減低。②gap-PCR擴增的缺失型片段(圖2d)根據(jù)其在血漿中的拷貝數(shù)來判斷胎兒是否為--SEA純合的方法，理論上Bart水腫胎兒產(chǎn)生的cfDNA含有缺失型片段是攜帶者胎兒的兩倍，可以借此將兩者區(qū)分，而懷有正常胎兒的孕婦只含有母源背景中的缺失型片段，含量最少。Pornprasert[22]利用半巢式qPCR絕對定量法對正常、攜帶者及Bart水腫胎兒3種胎兒進行區(qū)分，但差異不具有顯著性。該方法局限性在于缺乏對照基因，容易受加樣時初始模板量的影響，不能真實反映其在胎兒基因組及cfDNA中的真實含量；二是qPCR的檢測精度有限，微量cfDNA的并不導(dǎo)致模板量成倍改變，qPCR難以有效檢測。而數(shù)字PCR在極低的濃度下直接檢測樣本中目標(biāo)序列的拷貝數(shù)，而無需進行巢式、半巢式擴增，減少預(yù)擴增引起模板數(shù)量偏差，也避免兩次擴增中引入污染可能，能更真實反映cfDNA中模板含量。借助目標(biāo)基因/參照基因算法，根據(jù)不同基因型胎兒對應(yīng)的比值劃分成三組，若滿足組間具有顯著性差異，則可以劃定區(qū)分Bart水腫胎的臨界值，作為臨床孕婦血漿樣品中胎兒基因分型的依據(jù)。

3.3 數(shù)字PCR平臺應(yīng)用的局限性 不同平臺之間性能存在較大差異，以及不同技術(shù)原理、所需操作技術(shù)要求不同。例如，微滴數(shù)字PCR和芯片式數(shù)字PCR在通量、分散程度存在差別，微滴數(shù)字PCR分散體系生成更為簡便，對技術(shù)人員操作要求較低。此外不同的檢測儀器的準(zhǔn)確度、精確度存在差別，對不同的預(yù)擴增液、微滴發(fā)生油，兼容性存在差別。尤其是，微滴式數(shù)字PCR平臺之間由于微滴發(fā)生油的種類、微滴發(fā)生技術(shù)的差異，微滴數(shù)量為20 000～2 000 000不等，這樣可導(dǎo)致檢測精度存在差異，理論上，微滴數(shù)量越多，定量越精確。由于采用的技術(shù)不同，實驗室間難以形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。

此外，無創(chuàng)產(chǎn)前診斷需要明確cffDNA成分的比例，排除胎兒成分過低的樣品，避免假陰性結(jié)果而漏診。數(shù)字PCR在胎兒成分檢測方面具有穩(wěn)定、重復(fù)性高、精準(zhǔn)、快速等優(yōu)點，且定量的胎兒濃度較qPCR方法更高。但由于數(shù)字PCR檢測熒光通道有限，難以同時檢測多個分子標(biāo)記，仍然是局限數(shù)字PCR無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的因素。常用分子標(biāo)記包括男性胎兒的Y染色體序列及差異SNP位點。Y染色體序列具有性別特異性及胎兒特異性，Y染色體序列定量方法具有極高的敏感性，缺點是對于女性胎兒無法使用。差異SNP法僅局限于母親純合而胎兒雜合的SNP位點，通過胎兒區(qū)別于母親的堿基識別胎兒DNA，與母胎共有堿基含量比較可計算胎兒成分所占比例，但由于差異SNP不具有普適性，需要在人群中選取足夠區(qū)別意義的位點作為備選SNP，且需要在分析前同時獲得父母雙方大量SNP分型信息，篩選具有鑒別意義的位點，步驟煩瑣、工作量大，在有限的反應(yīng)中獲取足夠的胎兒差異分子標(biāo)記信息是十分困難的。

4 展望

地中海貧血是一種熱帶地區(qū)常見的單基因遺傳病，攜帶率及發(fā)病率高，已出生的重型地中海貧血患兒需要長期接受輸血和祛鐵治療，給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。Bart水腫胎作為α地中海貧血的最嚴(yán)重類型，具有胎兒致死性，發(fā)生率高。因此，迫切需要一種快速、準(zhǔn)確、早期的無創(chuàng)產(chǎn)前手段，能輔助現(xiàn)有介入性產(chǎn)前診斷技術(shù)，更早發(fā)現(xiàn)并確診胎兒基因型，以更早進行臨床干預(yù)。MPS憑借信息量大、通量高及其強大的生物信息學(xué)分析支持，目前仍是主流的無創(chuàng)檢測技術(shù)。其發(fā)展可分為兩個方向：一是利用更大深度的全基因組測序或構(gòu)建相應(yīng)的Panel，以及新的算法，在單次檢測中發(fā)掘更多的信息，能同時完成諸如染色體數(shù)目異常篩查(NIPT)、單基因病的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷(NIPD)等多種檢測。另一種是提高檢測針對性以及目標(biāo)區(qū)域胎兒成分的富集，如靶向捕獲測序或擴增子測序，提高富集效率和特異性，可發(fā)掘含量極低的胎兒成分信息，降低檢測閾值。然而在該策略上，數(shù)字PCR不僅成本較低、特異性高、檢測周期短、簡便、絕對定量，不易受建庫、測序深度、均一性影響，受檢測前處理技術(shù)影響因素小，檢測后分析更加簡便，更具有優(yōu)勢。隨著RMD策略在MPS和數(shù)字PCR平臺上證明其實用性，數(shù)字化定量平臺無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的基本策略逐步確立，如何減低技術(shù)因素及母源背景所致干擾，提高檢測技術(shù)靈敏度仍是重要課題。同時，數(shù)字化定量的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)與超聲篩查技術(shù)，以及血紅蛋白篩查、孕前咨詢、分子診斷相結(jié)合，實現(xiàn)早期發(fā)現(xiàn)重型地中海貧血患兒，降低重型地中海貧血發(fā)生率，減少非必要的有創(chuàng)產(chǎn)前檢查的使用，仍是地中海貧血無創(chuàng)產(chǎn)前診斷推向臨床必經(jīng)之路。