周榆林，陳 劍，鐘明葉，陳夢圓，蔡雪梅，李志軍，羅愛民

（1.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川成都610065； 2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443003）

中國白酒主要以香味獨特、酒體醇厚、優(yōu)雅細(xì)膩、空杯留香等特點而深受消費者喜愛[1-3]。微生物在傳統(tǒng)固態(tài)白酒釀造過程中對白酒的品質(zhì)、風(fēng)味起著至關(guān)重要的作用[4]，對其研究具有極高的理論和應(yīng)用價值。貴州省輕工業(yè)科學(xué)研究所采用先進的微生物培養(yǎng)和應(yīng)用技術(shù)，用麩皮接種純菌種發(fā)酵，并引入釀造工藝中，這是在國內(nèi)首次將細(xì)菌麩曲應(yīng)用到醬香型白酒的生產(chǎn)中[5]。滕巍等[6]從大曲中篩選得到1株高產(chǎn)乙酸乙酯酯化酶的霉菌，為提高大曲中酯含量奠定了一定基礎(chǔ)。陳夢圓等[7]將1株產(chǎn)酯香功能菌制成純種麩曲添加到酒醅中，顯著改善了酒醅的性質(zhì)。應(yīng)用純種微生物制成麩曲應(yīng)用到白酒的生產(chǎn)中，是以后科研工作的方向[8]。己酸乙酯作為濃香型白酒的特征香氣物質(zhì)[9]，其含量高低對白酒品質(zhì)有很大影響。酯化力是衡量大曲生酯生香能力的理化指標(biāo)[10]，也是反映大曲質(zhì)量優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一。因此研究酯化酶活力較高的菌株，增加酒曲的酯化力，對于提高白酒酯香、改善酒質(zhì)、縮短發(fā)酵周期有著重要意義。

四川大學(xué)陳劍等[11]從醬香型酒糟中篩選得到1株耐酸產(chǎn)酯細(xì)菌ZP-28，此株細(xì)菌具有顯著耐高溫耐酸特性，且酯化力較高，將其應(yīng)用在麩曲中具有明顯改善麩曲品質(zhì)的作用。本課題在此基礎(chǔ)上以該菌株為研究對象，采用分子生物學(xué)方法對其進行鑒定，并利用活菌計數(shù)法和分光光度法兩種不同的方法測定其生長曲線，采用單因素實驗考察了溫度、培養(yǎng)時間、接種量等培養(yǎng)條件對酯化力的影響，并在此基礎(chǔ)上采用正交法對上述發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，對改進制曲工藝，提高白酒酯香提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

菌株：從四川某酒廠的堆積成熟酒糟中分離篩選得到的1株耐酸產(chǎn)酯香細(xì)菌ZP-28，現(xiàn)保存于四川大學(xué)食品科學(xué)與新技術(shù)研究室。

試劑：本實驗中應(yīng)用的生化試劑均為分析純及以上級別，溶液由蒸餾水配制。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g。pH調(diào)節(jié)至7.0～7.2，121℃、0.1MPa條件下滅菌20 min后，冷卻倒平板，備用。

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化鈉10 g，pH調(diào)節(jié)至7.0～7.2，121 ℃、0.1MPa條件下滅菌20 min后冷卻，備用。

麩皮培養(yǎng)基：麩皮和稻殼按照8∶2的比例混勻，加水拌勻，加水量為總質(zhì)量的65%，潤糧2 h。結(jié)束后進行蒸煮，將鍋放于電爐上加熱，待有水蒸汽冒出后開始計時1 h，每隔15 min將原料翻1次，以保證均勻性。蒸煮結(jié)束后，將原料按10%比例裝瓶，放入滅菌鍋內(nèi)，121℃高壓滅菌30 min。

儀器設(shè)備：MJ-250型恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）、pHS-3C型酸度計（杭州奧力龍儀器有限公司）、SW-CJ-ID雙人單面超凈工作臺（江蘇凈化設(shè)備公司）、721紫外分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、YXQ-LS-30SII立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備）、2720 thermal cycler PCR 儀（Applied Biosysterms）、DYCP-31 DN電泳槽(北京六一儀器廠)、DYY-5穩(wěn)壓電泳儀(北京六一儀器廠)、FR980凝膠成像儀(上海復(fù)日科技儀器有限公司)、HC-2518R冷凍高速離心機(BBI)、3730XL測序儀(Applied Biosystems)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分析方法

酯化力測定：參照QB/T 4257—2011。

1.2.2 分子生物學(xué)鑒定方法

1.2.2.1 菌株DNA提取過程（1）稱取純種麩曲0.5 g，置于2 mL離心管中。（2）向離心管中加入1 mL裂解液，漩渦充分混勻。

（3）將離心管置于-20℃條件下冷凍40 min，取出后65℃水浴溶解。

（4）將離心管置于-20℃條件下冷凍20 min，取出后65℃水浴溶解。

（5）將離心管置于-20℃條件下冷凍15 min，取出后65℃加熱30 min。

（6）10000 r/min離心10 min，取上清液550 μL轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，應(yīng)避免吸到沉淀。

（7）向離心管中加入200 μL無水乙醇，漩渦瞬時混勻。

（8）按Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒的步驟提取。

（9）提取的DNA樣品于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 PCR擴增體系及程序

以細(xì)菌的基因組DNA為模板，用細(xì)菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增，PCR擴增體系見表1。引物序列如下：

表1 16S rDNA PCR擴增體系

循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性94℃維持4 min，之后30個循環(huán)的94℃變性45 s、55℃退火45 s和72℃延伸1 min，再以72℃修復(fù)延伸10 min。

瓊脂糖凝膠電泳：PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測判斷是否為陽性擴增。樣品和Marker的上樣量為4 μL。設(shè)定電壓為150 V，電泳時間15 min。接通電極，PCR產(chǎn)物由陰極向陽極移動。電泳結(jié)束后用FR980凝膠成像儀觀察。

1.2.2.3 PCR擴增產(chǎn)物純化和測序

成像觀察結(jié)束后，用干凈的手術(shù)刀片將含有目的片段的瓊脂糖凝膠塊切下，用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒，對含有目的DNA片段進行純化回收，回收效率可達80%，該試劑盒的膜結(jié)合液中不含有干擾酶活性的碘化鈉。最后洗脫得到的DNA溶液置于-20℃下保存或用于后續(xù)實驗。PCR產(chǎn)物用PCR引物直接測序。

1.2.2.4 序列比對方法

序列結(jié)果用NCBI在線工具Blast在Gene Bank內(nèi)與標(biāo)準(zhǔn)菌株比對，并用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株ZP-28生長曲線的測定方法

活菌計數(shù)法是將一定濃度的發(fā)酵菌液適當(dāng)稀釋后均勻涂布于平板上，培養(yǎng)一定時間后計量菌落數(shù)，繪制“培養(yǎng)時間-活菌數(shù)量”的關(guān)系圖?；罹嫈?shù)測定法步驟為，與生長曲線法采用同一體系菌液，根據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果將發(fā)酵液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后再涂布至牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基表面，每組實驗3個平行，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)后計數(shù)，并根據(jù)稀釋倍數(shù)計算每毫升菌液中的活菌數(shù)量。分光光度法則是根據(jù)菌懸液的透光量間接測定細(xì)菌的濃度，因為細(xì)菌懸浮液的濃度在一定范圍內(nèi)與吸光度成正比，可以用吸光度反映菌濃度。選擇在37℃溫度培養(yǎng)條件下，測定ZP-28號菌株在LB培養(yǎng)基中吸光值變化曲線，以未接種的培養(yǎng)基為空白樣，每隔1 h吸取3 mL培養(yǎng)基以進行OD值測定，并做活菌計數(shù)實驗，可以判斷菌體生長狀況。

1.2.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化實驗

選取培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度和接種量3因素考察對酯化力的影響。

1.2.4.1 培養(yǎng)時間對酯化力的影響

在37℃，3%接種量條件下，研究培養(yǎng)時間的影響，分別在48 h、60 h、72 h、84 h 4個培養(yǎng)時間下測定酯化力的大小，培養(yǎng)結(jié)束后取出，40℃烘干，保持水分在14%左右，取出粉碎測酯化力。每個時間做3個平行，重復(fù)3組實驗。

1.2.4.2 接種量對酯化力的影響

在37℃、72 h培養(yǎng)時間條件下，研究接種量的影響，分別以1%、2%、3%、4%4個接種量下測定酯化力的大小，培養(yǎng)結(jié)束后取出，40℃烘干，保持水分在14%左右，取出粉碎測酯化力。每個接種量做3個平行，重復(fù)3組實驗。

1.2.4.3 培養(yǎng)溫度對酯化力的影響

在3%接種量、72 h培養(yǎng)條件下，研究培養(yǎng)溫度的影響，在37℃、42℃、47℃、52℃ 4個培養(yǎng)溫度下測定酯化力的大小，培養(yǎng)結(jié)束后取出，40℃烘干，保持水分在14%左右，取出粉碎測酯化力，測定方法見1.2.1。每個溫度做3個平行，重復(fù)3組實驗。

1.2.4.4 正交實驗

正交實驗設(shè)計方法可通過少量的實驗點來獲得整個實驗域內(nèi)豐富的實驗信息，從而得出全面的結(jié)論，因此具有設(shè)計靈活、不需要獲得導(dǎo)數(shù)信息、實驗次數(shù)少、可靠性高、可多方向同時尋優(yōu)等特點。本實驗為3因素4水平正交實驗，正交實驗因素水平見表2。

2 結(jié)果與討論

2.1 ZP-28的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測判斷是否為陽性擴增。樣品和Marker的上樣量為4 μL。設(shè)定電壓為150 V，電泳時間15 min。接通電極，PCR產(chǎn)物由陰極向陽極移動。電泳結(jié)束后紫外成像觀察，結(jié)果見圖1。

表2 正交實驗表

圖1 PCR擴增跑膠結(jié)果

將測序所得到的16S rDNA全序列利用CExpress完成拼接，提交到Gene Bank數(shù)據(jù)庫，并應(yīng)用Blast軟件進行同源性搜索，序列結(jié)果用NCBI在線工具Blast在Gene Bank內(nèi)與標(biāo)準(zhǔn)菌株比對，并用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示，確定ZP-28是枯草芽孢桿菌。

2.2 ZP-28的生長曲線測定結(jié)果

ZP-28的生長曲線測定結(jié)果見圖3，左垂直軸是OD值，右垂直軸是活菌總數(shù)的對數(shù)值。由圖3可知，將菌株接種到LB液體培養(yǎng)基后，在0～6 h期間，OD值和活菌總數(shù)增加較慢，表明該菌株的生長很緩慢，此段時期內(nèi)該菌株處于延遲期；在6～24 h期間，OD值和活菌總數(shù)增加較快，表明該菌株生長速率最大，屬于對數(shù)生長期，該時期內(nèi)菌體數(shù)量在大量迅速的增加，當(dāng)生長到15 h時達到對數(shù)生長期的中期，取此時期的微生物作為種子液可以保證菌種的活性達到快速增殖的效果；培養(yǎng)24 h后，OD值和活菌總數(shù)增加較慢，表明該菌株進入穩(wěn)定生長期，也是積累代謝產(chǎn)物的一個階段，該期OD值有不顯著的上升，這可能是因為菌體細(xì)胞死亡后仍在培養(yǎng)液中，這會影響到吸光度的測定，從而使OD值仍有緩慢的上升跡象；30 h后，OD值和活菌總數(shù)有下降趨勢，這表明由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和代謝產(chǎn)物的積累抑制了微生物的生長繁殖，菌體量開始緩慢下降，OD值也隨著有所降低。

2.3 麩皮培養(yǎng)基優(yōu)化實驗結(jié)果

圖2 基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 生長曲線

2.3.1 培養(yǎng)時間對酯化力的影響

在37℃，3%接種量條件下，研究不同培養(yǎng)時間下酯化力高低，實驗結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，酯化力呈先增加后降低的趨勢。培養(yǎng)時間為48 h時，酯化力較低，其發(fā)酵不完全。當(dāng)培養(yǎng)時間為60 h時，麩曲的酯化力最高，與48 h的發(fā)酵產(chǎn)物酯化力相比有了較高的提高。繼續(xù)延長培養(yǎng)時間，酯化力不增反而呈降低趨勢。

圖4 不同培養(yǎng)時間的酯化力

2.3.2 接種量對酯化力的影響結(jié)果

在37℃，72 h培養(yǎng)時間條件下，研究不同接種量對酯化力的影響，實驗結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著接種量的增加，酯化力先增高后降低。接種量為1%時，發(fā)酵產(chǎn)物的酯化力較低。當(dāng)接種量為2%時，麩曲的酯化力最高，與1%接種量的發(fā)酵產(chǎn)物相比有了明顯的提高。之后增大菌種的接種量，發(fā)酵產(chǎn)物的酯化力沒有明顯的提高。

2.3.3 培養(yǎng)溫度對酯化力的影響

在3%接種量、72 h培養(yǎng)條件下，研究不同培養(yǎng)溫度對酯化力的影響，實驗結(jié)果見圖6。由圖6可知，隨著培養(yǎng)溫度的提高，酯化力先增高后降低。培養(yǎng)溫度為37℃時，發(fā)酵產(chǎn)物的酯化力隨著培養(yǎng)溫度的增加不斷提高，當(dāng)培養(yǎng)溫度為47℃時，麩曲的酯化力最高，隨后再提高培養(yǎng)溫度麩曲的酯化力呈現(xiàn)一定的下降趨勢。

圖5 不同接種量的酯化力

圖6 不同培養(yǎng)溫度的酯化力

2.3.4 正交實驗結(jié)果

單因素實驗結(jié)果顯示，選取的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)時間60 h，接種量2%，培養(yǎng)溫度47℃。為了更好地研究三因素之間的相互作用，進行正交實驗研究。如表3所示，正交實驗驗證結(jié)果表明：RC＞RA＞RB，所以各因素的主次順序為C＞A＞B，即接種量對酯化力影響最大，其次是培養(yǎng)溫度，對酯化力影響最小的是培養(yǎng)時間。選擇K值最大所對應(yīng)的培養(yǎng)條件，即接種量為2%，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間72 h，在該培養(yǎng)條件下預(yù)計酯化力較高。

由正交實驗結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)條件，即接種量為2%，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間72 h。根據(jù)該條件將2%種子液接種到麩皮培養(yǎng)基，于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，每隔幾小時搖勻1次，培養(yǎng)結(jié)束后取出烘干粉碎，測酯化力，結(jié)果為33.6 U±0.021 U，比其他培養(yǎng)條件下酯化力都要高，進一步驗證了正交實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表3 正交實驗結(jié)果

3 結(jié)論

將1株從郎酒酒糟中篩選得到的耐酸產(chǎn)酯香細(xì)菌ZP-28采用分子生物學(xué)鑒定，根據(jù)該菌株的16S rDNA序列分析結(jié)果顯示，該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。測定了ZP-28菌的生長動態(tài)，在6～24 h期間，該菌株生長速率最大，屬于對數(shù)生長期，該時期內(nèi)，一方面菌體數(shù)量在大量迅速的增加，培養(yǎng)24 h后該菌株進入穩(wěn)定生長期，在菌株培養(yǎng)末期OD值有不顯著的上升。因為菌株生長到15 h時，達到對數(shù)生長期的中期，取此時期的微生物作為種子液可以保證菌種的活性達到快速增殖的效果，最終確定菌液培養(yǎng)時間為15 h。以該菌株為出發(fā)菌株，分別從溫度、接種量、培養(yǎng)時間3方面設(shè)計單因素實驗研究發(fā)酵條件，在單因素實驗基礎(chǔ)上采用正交法設(shè)計實驗對ZP-28發(fā)酵條件進行優(yōu)化。正交結(jié)果顯示，接種量對酯化力影響最大，其次是培養(yǎng)溫度，對酯化力影響最小的是培養(yǎng)時間。最終確定在培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間72 h，接種量為2%的條件下得到的麩曲的酯化力較高，為33.6 U±0.021 U。深入生產(chǎn)實踐，還需要進一步進行工廠發(fā)酵實驗探討研究。