蔣英麗，鄧皖玉，王亞軍，鄧小波，李 娟，聶正東，張劍南，甘浪飛

（1.四川省古藺郎酒廠有限公司，四川古藺646523； 2.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都610064）

高溫制曲為開放式過程，各種環(huán)境微生物均參與到該過程中。隨著發(fā)酵溫度升高，醬香功能嗜熱菌就占據(jù)優(yōu)勢地位。當(dāng)曲塊溫度達(dá)到較高溫度時，翻曲、降溫?fù)Q氣，為優(yōu)勢功能菌的繼續(xù)生長、繁殖、代謝以及醬香味產(chǎn)生創(chuàng)造有利條件。推測在郎酒等醬香型白酒的高溫制曲過程中，其多個工藝步驟，包括升溫、翻曲以及換氣等，定向培養(yǎng)、篩選形成了一個相對穩(wěn)定的微生物菌群，確立了優(yōu)勢菌群。

通過高通量測序技術(shù)、重點針對郎酒高溫制曲過程中的6個階段，研究高溫制曲過程中“醬香功能菌群（細(xì)菌與真核微生物）”的組成與演化規(guī)律。該項研究結(jié)果對解析郎酒高溫制曲機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時亦為優(yōu)化制曲工藝、監(jiān)測曲塊品質(zhì)、提升醬香型酒產(chǎn)量以及品質(zhì)，提供理論指導(dǎo)。

表1 郎酒高溫制曲進(jìn)程中曲塊樣本信息

表2 PCR擴(kuò)增所用引物序列信息

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

曲塊樣品收集：采集高溫制曲過程中6個關(guān)鍵階段曲塊，采樣從制曲最佳的端午時節(jié)開始，取樣時間跨度5個月，前后共計收集30塊曲塊（表1）。

試劑及耗材：美國MO Bio公司生產(chǎn)的Power-Soil DNA Isolation Kit、百邁克微生物高通量測序建庫試劑盒、美國BioLabs公司Phusion HF MM高保真PCR酶、德國Qiagen公司MinElute?PCR Purification Kit、美國Illumina公司Sample Preparation Kit、全式金Taq DNA Polymerase、北京華大公司的合成引物、西班牙瓊脂糖Agarose、全式金Marker DL5000、Goldview Nucleic Acid Gel Stain等。

儀器設(shè)備：高通量測序平臺（美國Illumina HiSeq 2500）、PCR儀（美國Bio-Rad S1000）、熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad CFX96）、凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad Gel Doc?XR+）、低溫冷凍離心機(jī)（德國Beckman Allegra X-22R）。

1.2 試驗方法

1.2.1 曲塊菌群基因組DNA的提取

本實驗曲塊菌群總DNA提取按照PowerSoil DNA Isolation Kit說明進(jìn)行。

1.2.2 曲塊菌群DNA文庫建立與測序分析

曲塊菌群DNA質(zhì)量經(jīng)檢測合格后，通過針對V3+V4區(qū)域或者ITS區(qū)域的特異性引物（表2）分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物純化后利用Illumina公司的 Tru-Seq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit制備測序文庫并添加接頭序列，文庫經(jīng)過Thermo NanoDrop 2000測定質(zhì)量后，利用Illumina HiSeq 2500進(jìn)行高通量測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

對于測序得到的序列信息，首先根據(jù)PE reads之間的Overlap關(guān)系，將Hiseq測序得到的雙端序列數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接以獲得完整的一條序列Tags，同時對Reads的質(zhì)量和拼接的效果進(jìn)行質(zhì)控過濾。之后利用不同軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，如QIIME軟件進(jìn)行OTU劃分，基于Silva和UNITE分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋分析、利用MEGAN軟件分析樣品中所有微生物的進(jìn)化關(guān)系和豐度差異，利用Mothur軟件對樣品進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)評估等。

2 結(jié)果與分析

2.1 曲塊菌群基因組DNA的提取及質(zhì)量檢測

采用PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒，本研究提取了30個曲塊菌群的總DNA。采用超微量分光光度計（Thermo NanoDrop 2000），檢測了菌群總DNA的OD260/OD280比值，發(fā)現(xiàn)該比值介于1.80～1.90之間，同時，瓊脂糖凝膠（0.8%）電泳結(jié)果也顯示出清晰的DNA條帶。結(jié)果表明，樣本基因組DNA質(zhì)量較好（圖1）。

以提取菌群總DNA為模板，針對細(xì)菌16S rDNA的V3+V4區(qū)和真核微生物的ITS1區(qū)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功獲得擴(kuò)增目的條帶（圖2）。表明該菌群總DNA樣品質(zhì)量合格，可用于后續(xù)菌群DNA的PCR擴(kuò)增與建庫、及高通量測序分析。

圖1 4個曲塊（T4階段：T4a-d）菌群總DNA的凝膠電泳結(jié)果

圖2 曲塊細(xì)菌16S rDNA基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果與真核微生物ITS1區(qū)的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 高溫制曲過程中細(xì)菌種類多樣性及菌群演化趨勢

采用16s rDNA高通量測序技術(shù)，本項目共計測定了30個曲塊菌群總DNA樣本（表3），共獲得4,003,221對Reads，雙端Reads拼接、過濾后共產(chǎn)生3,107,567條Clean tags，平均每個樣品產(chǎn)生103,586條 Clean tags。

2.2.1 各階段曲塊細(xì)菌種類具多樣性

在各階段曲塊中，共計發(fā)現(xiàn)291個分類操作單元（OTU），具多樣性（圖3A）；OTU數(shù)量在不同階段曲塊中，具明顯差異（圖3B）：與新入庫曲塊（T0）相比，在第1次（T1）和第2次翻曲（T2）時，曲塊細(xì)菌OTU數(shù)量有顯著增加；在第3次翻曲（T3）時，OTU數(shù)量急劇下降；在新制成品曲（T4）和儲藏3月的成品曲塊（T5）中，OTU數(shù)目趨于穩(wěn)定。

使用Mothur（version v.1.30）軟件，對樣品Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行評估。為比較樣品間的多樣性指數(shù)，分析時將樣品所含序列數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。在97%相似度水平下，各樣品Alpha多樣性指數(shù)值統(tǒng)計如表3，在T1和T2期,曲塊細(xì)菌多樣性較高；在T0、T4和T5期，多樣性較低；T3期的多樣性最低。4種計算算法的結(jié)論基本一致。

2.2.2 各階段曲塊共有或特征性具有OTU

在明確曲塊中OTU個數(shù)后，利用Venn圖可以展示樣品之間共有或特有OTU數(shù)目，直觀地表現(xiàn)出樣品間OTU的重合情況。結(jié)合OTU所代表的物種，可找出不同環(huán)境中的共有或特有微生物。分析表明：在制曲不同階段，共計發(fā)現(xiàn)100個OTU為各階段曲塊所共有；在T0、T1、T5期，曲塊中特有OTU數(shù)目分別為10個、2個和28個；在T2、T3和T4階段，無特有OTU（圖4）。

圖3 不同階段曲塊細(xì)菌OTU個數(shù)分布圖與各階段曲塊細(xì)菌OTU數(shù)目變化趨勢

表3 各階段曲塊細(xì)菌菌群的Chao1、Ace、Shannon、Simpson指數(shù)

圖4 OTU venn圖示各階段曲塊中共有或特有細(xì)菌OTU數(shù)目

多個顏色圖形之間交疊部分?jǐn)?shù)字為多個階段曲塊間共有OTU數(shù)目，非交疊部分為特有OTU數(shù)目。

2.2.3 細(xì)菌菌群演化趨勢解析

從細(xì)菌科、屬分類水平上看，各階段曲塊菌群的種類及其相對豐度差異較大，多個優(yōu)勢菌群在高溫制曲進(jìn)程中顯現(xiàn)（圖5）。在制曲T1（第1次翻曲）和T2（第2次翻曲）階段，曲塊溫度上升后，Kroppenstedtia（屬Thermoactinomycetaceae科）迅速演化為優(yōu)勢菌屬，其相對豐度占50%～60%；此外，該菌群在T3（第3次翻曲）、T4（新制成品曲）、T5（儲藏成品曲）階段中，始終作為優(yōu)勢菌屬，其相對豐度高于60%（圖5）。同時，高溫放線菌屬（Thermoactinomyces，能在50～85℃高溫中生長）在T1和T2階段，其在曲塊菌群中的相對豐度亦高于5%；糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）在T2階段，亦成為優(yōu)勢菌屬，約占10%，后期階段比例降低；芽孢桿菌屬（Bacillus）在T1期開始出現(xiàn)，T2和T4期都占較大比例；Staphylococcus（葡萄球菌屬）在T2期開始亦逐漸成為優(yōu)勢菌屬。

圖5 科水平細(xì)菌種類分布柱狀圖與屬水平細(xì)菌種類分布柱狀圖

在新制成品曲（半成品曲）的儲藏過程（T4→T5）中，曲塊個別優(yōu)勢菌屬相對豐度有顯著變化。如：芽孢桿菌屬（Bacillus）相對豐度急劇降低。在制曲T1和T2階段，高溫（59～65℃）對優(yōu)勢菌群有明顯富集效應(yīng)，使優(yōu)勢菌屬（如Kroppenstedtia）趨于穩(wěn)定。在制曲后期，隨溫度降低，個別優(yōu)勢菌群相對豐度有降低或恢復(fù)的情況。有趣的是，在制曲各階段，仍有部分未知菌群待鑒定。

圖6 不同階段曲塊真核微生物OTU個數(shù)分布圖（A）與各階段曲塊OTU數(shù)目變化趨勢（B）

表4 曲塊真核微生物類群的Chao1、Ace、Shannon、Simpson指數(shù)

2.3 高通量測序揭示高溫制曲過程中真核微生物種類多樣性及菌群演化趨勢

本研究對30個曲塊真核微生物基因組DNA的ITS1區(qū)進(jìn)行測序，共獲得2,401,020對Reads，雙端Reads拼接、過濾后共產(chǎn)生1,958,852條Clean tags，平均每個樣品產(chǎn)生65,295條Clean tags。

2.3.1 各階段曲塊真核微生物多樣性

在各階段曲塊中，基于UNITE（真菌）分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋，共計發(fā)現(xiàn)102個分類操作單元（OTU）。如圖6所示，在不同階段曲塊中，OTU數(shù)目具明顯差異；在制曲進(jìn)程中，真核微生物種類（OTU數(shù)目）在第1次（T1）和第2次（T2）翻曲時，顯著減少。在第3次翻曲（T3）時，曲塊OTU數(shù)量減少至最低水平，在新制成品曲（T4）和放置3月的成品曲塊（T5）中，OTU數(shù)目趨于穩(wěn)定；制曲進(jìn)程中，曲塊真核微生物OTU數(shù)量的變化趨勢與細(xì)菌OTU數(shù)量的變化趨勢不同。

通過多樣性指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)：在T0、T1和T2期曲塊中，真核微生物多樣性較高；在T3、T4和T5期，多樣性較低。4種計算方法的結(jié)論基本一致（表4）。該數(shù)據(jù)亦表明，真核微生物在制曲過程中，在外界（如溫度）條件影響下，真核微生物的多樣性呈下降趨勢。

多個顏色圖形間交疊部分?jǐn)?shù)字為多個階段曲塊間共有OTU數(shù)目，非交疊部分為特有OTU數(shù)目。

2.3.2 各階段曲塊中共有或特有真核微生物OTU

分析表明：17個真核微生物OTU可在各階段（T0—T5）曲塊樣品中檢測到。T0期特有OTU數(shù)目為3個；T1、T2、T5期曲塊特有OTU數(shù)目分別為1個、2個和2個；在T3、T4期曲塊中，無特有OTU，在制曲各階段中尤為特殊（圖7）。

圖7 OTU venn圖示各階段曲塊中共有或特有真核微生物OTU數(shù)目

2.3.3 真核微生物菌群的演化趨勢解析

從屬分類水平上看，各階段曲塊中，真核微生物種類及其相對豐度變化顯著。在同一制曲階段中，不同曲塊中真核微生物種類及其相對豐度差異不明顯；在不同階段，曲塊真核微生物種類及其相對豐度差異較大，優(yōu)勢菌屬在高溫制曲進(jìn)程中顯現(xiàn)（圖8）。在T0期，真核微生物種類較多。其中，存在大量未知真核微生物；在第1次翻曲時（T1），真核微生物種類顯著減少，嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、Rasamsonia菌屬（一種新發(fā)現(xiàn)耐熱或嗜熱真菌）、紅曲霉屬（Monascus）、曲霉屬（Aspergillus）逐漸富集，成為優(yōu)勢菌屬；在第2次翻曲（T2）時，紅曲霉屬、Rasamsonia和Thermoascus成為優(yōu)勢菌屬。其中，紅曲霉屬相對豐度最高，約占40%；在T3和T4期，優(yōu)勢菌屬為嗜熱子囊菌屬、Rasamsonia和Thermomyces（嗜熱真菌屬），其中，嗜熱子囊菌屬相對豐度占40%～60%。與T3和T4曲塊類似，在儲 藏 曲 塊（T5）中 ，Thermoascus、Thermomyces、Rasamsonia和Aspergillus等為優(yōu)勢菌群，但其相對豐度變化顯著。如Thermomyces的相對豐度由T3、T4階段的3%提升到40%。此外，未知菌群相對豐度急劇降低。

圖8 屬水平真核微生物物種分布柱狀圖

2.4 高溫制曲過程中，細(xì)菌與真核微生物菌群的演化趨勢比較

通過對郎酒高溫制曲進(jìn)程中，細(xì)菌與真核微生物菌群演化規(guī)律比對分析，可發(fā)現(xiàn)一些共同特征：（1）新曲入庫時（T0），微生物種類較多，但優(yōu)勢菌群未顯現(xiàn)；（2）在第1次翻曲（T1，65℃）和第2次翻曲（T2，59℃）階段，耐高溫優(yōu)勢菌群顯現(xiàn)和富集，表明高溫對曲塊優(yōu)勢菌群有篩選與富集效應(yīng)；（3）與T1和T2相比，在T3、T4階段，優(yōu)勢菌群的組成及其豐度均有變化；（4）在后期儲藏（T5）過程中,部分優(yōu)勢菌群相對豐度顯著提升或減少。表明，曲塊儲藏是制曲必要階段。

此外，我們還發(fā)現(xiàn)，制曲進(jìn)程中，細(xì)菌與真核微生物種類的變化趨勢有差異（圖9）。細(xì)菌微生物種類遠(yuǎn)比真菌豐富，細(xì)菌種類從入庫（T0）到第1次翻曲（T1，≈65℃）和第2次翻曲（T2，≈59℃）階段，增加近30%，在第3次翻曲（T3，≈43℃）階段，與溫度銳降趨勢一致，其種類相比T2減少了近52%，在之后儲存階段（T4、T5，≈37℃），細(xì)菌種類略微增加。相反，在整個制曲進(jìn)程中，真核微生物的變化趨勢為種類持續(xù)減少。在第1次翻曲和第3次翻曲階段種類分別銳減28%和59%，之后，微生物種類較為穩(wěn)定。

圖9 郎酒高溫制曲過程中細(xì)菌與真菌OTU數(shù)量變化趨勢與溫度變化趨勢

通過高溫制曲的菌群演化規(guī)律分析，一方面可通過分析菌群演化特征，為監(jiān)測曲塊品質(zhì)差異提供理論支持。同時，也為優(yōu)化制曲工藝，如縮短曲塊儲藏時間、改變儲藏條件、調(diào)節(jié)曲房條件（如溫度、通風(fēng)）等，奠定基礎(chǔ)。最終為提升與穩(wěn)定酒品質(zhì)、降低制曲生產(chǎn)成本提供科學(xué)依據(jù)。

3 小結(jié)

綜上所述，通過高通量測序技術(shù)，首次針對郎酒高溫制曲進(jìn)程中，細(xì)菌與真核微生物的多樣性、菌群演化規(guī)律以及優(yōu)勢菌群進(jìn)行了系統(tǒng)探究。

（1）首次揭示在郎酒高溫制曲進(jìn)程中，細(xì)菌與真核微生物種類具多樣性，但細(xì)菌與真核微生物變化趨勢差異顯著。

（2）發(fā)現(xiàn)在制曲早期階段，高溫對醬香功能菌群的篩選與富集效應(yīng)明顯，促使優(yōu)勢菌群富集與顯現(xiàn)。同時，亦發(fā)現(xiàn)后期儲藏對曲塊部分優(yōu)勢菌群的相對豐度具明顯影響。

（3）本研究也發(fā)現(xiàn)一定比例未知菌群。這類菌群對高溫制曲的影響值得深度挖掘。

本課題研究將為解析郎酒高溫制曲機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時，亦為優(yōu)化高溫制曲工藝、監(jiān)測曲塊品質(zhì)、提升酒產(chǎn)量與品質(zhì)等提供理論指導(dǎo)。